两栖类动物皮肤分泌物的相关研究

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在脊椎动物演化过程中，两栖类动物是由水生到陆生的过渡型，其中很多物种具有食用或医药保健等价值，因此是重要的生物资源。

两栖动物的皮肤分泌液中含有大量能够杀灭微生物、防御天敌的生物胺和活性多肽,其中生物胺与活性多肽的含量之高是哺乳类动物无可比拟的，因而被称为生物胺与活性多肽的巨大储存库。其皮肤分泌液中含有4大类生物化学成分,即生物胺、蟾蜍配基、生物碱、多肽和蛋白质[1]，其中最丰富的是抗菌肽。蛙皮抗菌肽于20世纪70年代被人们发现，但是一直没有受到重视，直至从非洲爪蟾中提取出了蛙皮抗菌肽Magainins族，人们才开始重视对抗菌肽的研究[2]。

1 材料及试剂

（1）实验动物。非洲爪蟾、兰州地区的中国林蛙、中华大蟾蜍及花背蟾蜍。

（2）菌株。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌和红色毛廯菌。

（3）溶液和培养基。①SDS-PAGE浓缩胶和分离胶的配制。配制12%分离胶5mL：去离子水1.6mL、30%丙烯酰胺 2.0mL、 1.5%Tris-HCl1.3mL、10%SDS 0.05mL、10%过硫酸铵 0.05mL(现配现用)、TEMED 0.002mL；配制5%浓缩胶2mL:去离子水1.4mL、30%丙 烯 酰 胺 0.33mL、1.0Tris-HCl0.25mL、10%SDS 0.02mL、10%过硫酸铵 (现配现用)0.02mL、TEMED 0.002mL。②液体培养基。NaCl5.0g、胰蛋白胨5.0g、酵母提取物2.5g，加入去离子水500mL，充分搅拌使其完全溶解，用浓度为2mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，120℃高压灭菌15分钟。③LB固体培养基。向配制好的500mL液体培养基中加入7.5～10g琼脂粉，120℃高压灭菌15分钟。

2 两栖类动物皮肤分泌物的提取方法

（1）乙醚刺激。将活体非洲爪蟾、中国林蛙、中华大蟾蜍及花背蟾蜍的皮肤表面用超纯水清洗干净，用酒精棉球擦干净，然后将其分别放置于1000mL烧杯中，滴加1mL的无水乙醚，盖住烧杯口，使烧杯密闭，静置1分钟。这4种试验动物均表现狂躁不安，奋力挣扎，最终麻醉昏迷。随后取出4种试验动物置于容器中，5分钟后中国林蛙背部有少量的泡沫状物质分泌出来，非洲爪蟾的背部及后腿部有大量泡沫状物质分泌出来，花背蟾蜍的背部有淡黄色液滴状物质分泌出来，中华大蟾蜍背部皮肤处有泡沫状物质分泌出来，同时非洲爪蟾、中国林蛙、中华大蟾蜍及花背蟾蜍随着分泌物产生的过程其皮肤颜色渐渐变浅。将提取出来的分泌物收集，保存到-20℃冰箱备用。

（2）肾上腺素刺激。将活体非洲爪蟾、中国林蛙、中华大蟾蜍及花背蟾蜍的皮肤表面用超纯水清洗干净，用酒精棉球擦干净，分别给4种试验动物背囊部注射盐酸肾上腺素0.25mL。注射肾上腺素后非洲爪蟾的后背部立即有大量白色泡沫状物质分泌出来，花背蟾蜍的耳后腺处有淡黄色液滴分泌出来，而背部没有分泌物，2分钟后中国林蛙和中华大蟾蜍背部均有少量的泡沫状物质分泌出来，同时非洲爪蟾、中国林蛙及中华大蟾蜍随着分泌物产生的过程其皮肤颜色渐渐变浅。将提取出来的分泌物收集，保存到-20℃冰箱备用。不同的提取方法适用于不同的两栖类动物。在提取两栖类动物皮肤分泌物前，了解该两栖类动物皮肤属于哪种类型，最终采用与之匹配的提取方法。

3 皮肤分泌物体外抑菌性观察

（1）方法。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌和红色毛廯菌4种细菌分别接种于液体培养基中，放置于摇床上培养20小时。再将液体培养基中的菌液吸取50μL于含有固体培养基的培养皿中，用涂布棒涂抹均匀。每种菌液涂抹4个培养基，分别标记1～4号，再将用乙醚方法刺激分泌的各种皮肤分泌物抗菌肽的粗提物吸取5μL分别滴加至1号培养皿中；将用去甲肾上腺素刺激分泌的各种皮肤分泌物抗菌肽吸取5μL分别滴加至2号培养皿中；3号培养皿中分别滴加5μL灭菌水；4号培养皿作为对照。将上述培养皿置于温箱中培养12小时和24小时，观察其抑菌效果。

（2）结果。见表1和表2。

表1 乙醚方法提取的两栖动物皮肤分泌物抑菌活性

表2 肾上腺素方法提取的两栖动物皮肤分泌物抑菌活性

（3）结论。通过对非洲爪蟾、兰州地区的中国林蛙、中华大蟾蜍及花背蟾蜍4种实验动物皮肤分泌物的体外抑菌作用进行研究，发现非洲爪蟾的抑菌效果相对于其他3种动物更好，并且两栖类动物皮肤分泌物对细菌及真菌都有较好的抑菌效果。不同的刺激方法提取出来的抗菌肽粗提物的抑菌效果也有细微的差异。由于非洲爪蟾皮肤分泌物不仅量多，而且抑菌效果较好，因此对非洲爪蟾皮肤分泌物中抗菌肽需做进一步的研究。

4 非洲爪蟾皮肤分泌物SDS-PAGE检测

（1）SDS-PAGE检测方法。十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋白质,并可测定蛋白质的相对分子量。经制备凝胶、点样、电泳、染色和脱色后，以Marker为标准，测出非洲爪蟾皮肤分泌物抗菌肽的相对分子量。

（2）结果。根据lgMW=K-bx(x为迁移率)可得出非洲爪蟾皮肤分泌物中活性蛋白分子量在20～90KD及小于20KD的小分子多肽。

5 讨论

研究发现，两栖类动物抵御外来微生物入侵是通过其皮肤分泌的抗菌肽来完成的[3]。试验通过对两栖类动物皮肤分泌物提取方法的比较以及抑菌活性的观察，对非洲爪蟾皮肤分泌物分子量的测定，得出乙醚方法提取分泌物适用于皮肤薄、皮肤腺较为发达的两栖类动物，而且得到分泌物的量较肾上腺素方法的多。肾上腺素方法提取分泌物适用于耳后腺发达的两栖类动物，由此发现不同的方法适用于不同的两栖动物物种。

在提取两栖类动物的皮肤分泌物前，了解该物种的皮肤属于哪种结构及分泌方式，采取合适的采集方法[4]。非洲爪蟾和中国林蛙皮肤分泌物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及红色毛廯菌都有抑菌效果，两栖动物皮肤分泌物对大部分试验菌株均具有不同程度的抑菌活性[5]。两栖动物皮肤分泌物中抗菌肽抑菌效果可能作用于细菌细胞壁，细胞壁一旦被破坏就会引起细菌细胞结构的变化和细胞死亡。可能作用于细菌细胞膜，抗菌肽穿过第一道屏障-细胞壁后接触到细菌细胞膜，氨基酸残基与磷脂双分子在静电作用下发生结合。非洲爪蟾皮肤分泌物活性蛋白分子量大小为20～90KD以及小于20KD的活性多肽，从而推断出抑制细菌生长的活性物质为抗菌肽。