乏白细胞富血小板血浆与富白细胞富血小板血浆对兔牙髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

潘磊，蔡东成，吴刚

(解放军第八五医院，上海200052)

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于修复衰老和疾病引起的组织器官损伤[1]。牙髓干细胞是一类起源于神经嵴细胞的未分化细胞，因其表面表达多种间充质干细胞标志物，且具有自我增殖和多向分化潜能，被认为是一种潜在的成体干细胞。由于牙髓干细胞具有牙髓源性，故其成骨作用更加明显[2～4]。因此，越来越多的研究探索牙髓间充质干细胞的成骨分化特点以及促进其成骨分化的条件。富血小板血浆是一种通过离心方式从血液中提取的富含血小板的液性复合物，通过激活血小板释放大量生长因子，促进细胞增殖、分化等，继而促进组织修复[5]。由于不同研究的富血小板血浆存在成分差异，导致其临床作用效果不同[6]。白细胞是血液的重要成分之一，可参与机体的防御反应，但亦可释放大量炎性因子。目前富血小板血浆中的白细胞对软骨细胞、肌腱干细胞分化的影响已有报道，但其对牙髓间充质干细胞分化的影响尚不明确。2016年7月～2017年6月，本研究观察了乏白细胞富血小板血浆(以下称乏白细胞血浆)与富白细胞富血小板血浆(以下称富白细胞血浆)对牙髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响。现分析结果并报告如下。

1 材料

雄性新西兰大白兔10只，6～8月龄，体质量3～4 kg，购于上海市松联动物场，动物许可证号：SCXK(沪)2007-0011。TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜，德国Leica公司；FACSCalibur全自动多色分析流式细胞仪系统，美国BD公司。CCK-8试剂，上海翊圣生物科技有限公司；RIPA裂解液，上海碧云天生物技术有限公司。CD34抗体(GTX75441)、CD45抗体(GTX116018)、CD105抗体(GTX11415)，美国GeneTex公司；CD90抗体(ab226)，美国Abcam公司；STRO-1抗体，美国R&D公司。NS、Runt相关转录因子2(Runx-2)、GAPDH一抗及相应二抗，美国Sigma公司。

2 方法与结果

2.2 兔牙髓间充质干细胞分离、培养与鉴定 所有大白兔适应性喂养1周，氯胺酮10 mg/kg与盐酸塞拉嗪0.2 mL/kg序贯肌肉注射麻醉。完整拔出上下门牙各2颗，75%乙醇消毒表面，无菌D-PBSA反复冲洗，小心取出牙髓，用手术刀片将牙髓切成直径约1 mm的组织块，置于3%Ⅰ型胶原酶与4%中性蛋白酶等体积混合的消化液中，37 ℃持续振荡消化1 h，500 g离心10 min，去上清，加入含20%FBS的DMEM培养液重悬。将细胞悬液转移至T25培养瓶中培养，待细胞集落形成后，局部消化，收集形成集落的细胞团，即牙髓原代间充质干细胞。将获得的牙髓原代间充质干细胞接种于T25培养瓶中，每3天换液1次，待细胞生长融合80%～90%时传代。取传4代、对数生长期、生长状态良好细胞，胰酶消化、计数，PBS重悬，制成密度为1×106个/mL的细胞悬液，加入HAB 50 μL充分混匀，室温静置1 min以上；然后加入连接有荧光素的抗体(CD34、CD45、CD90、CD105、Stro-1)孵育20～60 min，200目纱布过滤后上流式细胞仪鉴定。CD90、CD105、Stro-1为间充质干细胞阳性标志物，CD34为造血源性细胞标志物，CD45为血源性细胞标志物，CD34、CD45作为鉴定牙髓间充质干细胞的阴性对照。结果显示，CD90阳性率为96.3%、CD105阳性率为98.9%、Stro-1阳性率为99.2%，而CD34阳性率为2.5%、CD45阳性率为1.2%，表明分离、培养的牙髓细胞符合间充质干细胞要求，且纯度较高。

2.3 乏白细胞血浆与富白细胞血浆制备 大白兔拔完牙后取耳中动脉血10 mL，加入1/6体积的酸性柠檬酸葡萄糖溶液混匀，2 300 g离心100 s，按两次离心法分别制备乏白细胞血浆和富白细胞血浆。简要步骤如下：留取离心上清液与中间白细胞层，上2/3上清液用于制备乏白细胞血浆，下1/3上清液与中间白细胞层用于制备富白细胞血浆；上2/3上清液、下1/3上清液与中间白细胞层均经2 200 g离心5 min，弃上清(上清为乏血小板血浆)，留取下方血小板团，用乏血小板血浆重悬，并调节血小板密度约为全血血小板密度的3倍，最终获得血浆即为本研究所需乏白细胞血浆和富白细胞血浆。经血液检测仪检测，兔全血中白细胞平均密度为4.67×103/μL、血小板平均密度为3.05×105/μL，乏白细胞血浆中白细胞平均密度为<100/μL、血小板平均密度为9.46×105/μL，富白细胞血浆中白细胞平均密度为9.89×103/μL、血小板平均密度为9.42×105/μL。结果显示，本研究获得的乏白细胞血浆与富白细胞血浆的血小板平均密度相似，约为全血血小板平均密度的3倍。乏白细胞血浆中白细胞含量极少，富白细胞血浆中白细胞密度为全血白细胞平均密度的2.1倍。

2.4 乏白细胞血浆与富白细胞血浆对牙髓间充质干细胞增殖的影响 采用CCK-8法。取传4代、对数生长期、生长状态良好的牙髓间充质干细胞，以2×103个/孔接种于24孔Transwell小室底层，孔内含2% FBS的DMEM培养液，待细胞贴壁后分为乏白细胞组及富白细胞组，分别于Transwell小室上层加入乏白细胞血浆及富白细胞血浆。将两组培养液中的血浆浓度分别调节至0、2%、5%、10%、15%，继续培养72 h，移除Transwell小室上层，完全吸出底部培养皿的原培养液，加入新鲜含2% FBS的DMEM培养液，再加入占培养液体积比10%的CCK-8溶液，37 ℃继续培养2 h。采用分光光度计于450 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=实验孔OD450值-空白孔OD450值。结果显示，两组相同浓度血浆培养后细胞增殖率比较均无统计学差异(P均>0.05)；当血浆浓度为0～10%时，两组干细胞增殖率均随血浆浓度升高而升高(P均<0.05)；当血浆浓度为15%时，两组细胞增殖率比较无统计学差异(P>0.05)。结果见表1。以上结果提示，两种血浆浓度超过10%时促细胞增殖效果均进入平台期。故本研究选取10%浓度的血浆进行后续研究。

表1 两组不同浓度血浆培养对牙髓间充质干细胞增殖能力的影响

注：与同组无血浆比较，*P<0.05；与同组2%浓度血浆比较，#P<0.05；与同组5%浓度浆比较，△P<0.05。

2.5 乏白细胞血浆与富白细胞血浆对牙髓间充质干细胞成骨分化的影响 取传4代、对数生长期、生长状态良好的牙髓间充质干细胞，以1×104个/孔接种于24孔Transwell小室底层中，孔内含2%FBS的DMEM培养液，随机分为乏白细胞组、富白细胞组、对照组，乏白细胞组、富白细胞组、对照组分别加入10%乏白细胞血浆、10%富白细胞血浆和10%乏血小板血浆，继续培养2周，收集细胞。采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，经考马斯亮蓝法蛋白浓度测定试剂盒测定，提取的细胞总蛋白浓度合格，然后加入4×SDS-PAGEloadingbuffer，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白150 μL行SDS-PAGE(5%浓缩胶、12%分离胶)，100 V恒压电泳60 min。电泳结束，采用半干转膜法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，5%牛奶+TBS-Tween-20室温封闭1 h；分别加入羊抗兔牙髓间充质干细胞标志物NS一抗(1∶400)、鼠抗兔成骨分化标志物Runx-2(1∶200)一抗、鼠抗兔GAPDH(1∶200)一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBS洗膜10 min×3次，分别加入兔抗羊二抗(1∶1 000)或兔抗鼠二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h。TBS洗膜10 min×3次，ECL发光，暗室中曝光、显影，显微镜下拍照观察。采用Image J软件分析NS和Runx-2蛋白电泳条带的灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。结果见表2。

表2 各组NS、Runx-2相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与富白细胞组比较，#P<0.05。

3 讨论

通常认为，血小板的作用主要是止血。近年来随着对血小板认识的不断深入发现，血小板中富含大量的生物活性成分，如细胞趋化因子、生物小分子、生长因子、黏性蛋白以及酶类，可明显提升细胞的增殖能力。研究证实，富血小板血浆具有较强的促细胞增殖分化能力[7～9]，有望用于牙齿、骨等组织损伤修复[10～12]。但临床研究结果还存在争议，产生争议的原因是富血小板血浆中白细胞的存在是否影响富血小板血浆的效果[13]。白细胞不但具有很强的抵御病原菌作用，还能释放大量的炎性因子，而这些炎性因子可能抑制细胞活性，特别是干细胞活性。目前已在肌腱干细胞及软骨细胞等领域证实，富血小板血浆中含有白细胞会对细胞分化产生负面影响，但富白细胞血浆和乏白细胞血浆对牙髓干细胞分化的影响尚无相关报道。

本研究结果显示，从新西兰大白兔中提取的牙髓干细胞纯度较高，符合间充质干细胞要求。本研究细胞增殖实验结果显示，乏白细胞组与富白细胞组各浓度血浆作用后细胞增殖率比较均无统计学差异，说明两种血浆均能促进牙髓间充质干细胞增殖，血浆中含有白细胞不会明显影响细胞增殖。血浆浓度为0～10%时，随浓度增加，牙髓间充质干细胞增殖率逐渐升高；但当血浆浓度超过10%时，二者促增殖效果均进入平台期，促增殖效果不再明显。与Zhou等[13]研究结果类似。说明在牙髓间充质干细胞培养时血浆浓度并非越高越好。

NS是牙髓间充质干细胞的干性标志物。Runx-2是转录因子Runxx的家族成员之一，是骨细胞的特异转录因子，在骨组织形成、重建及促进软骨细胞成熟方面具有重要作用，是间充质干细胞向成骨细胞分化的重要参考标志物之一。本研究成骨分化实验结果显示，乏白细胞组与富白细胞组NS相对表达量比较无明显统计学差异，说明乏白细胞血浆与富白细胞血浆对牙髓间充质干细胞的促分化作用无明显差异；乏白细胞组Runx-2相对表达量明显高于富白细胞组，说明乏白细胞血浆较富白细胞血浆具有更强的促牙髓干细胞成骨分化作用，即富白细胞血浆对细胞分化具有一定的抑制作用。有研究显示，富白细胞血浆处理软骨后，软骨细胞中分解代谢因子(如MMP-1)以及炎症因子(如IL-1、IL-6)表达明显升高，而乏白细胞血浆处理后软骨细胞的Ⅱ型胶原表达明显高于前者[14]。Wang等[15]研究亦证实，富白细胞血浆可激活牙髓间充质干细胞的炎性状态和分解代谢，促进其产生更多的IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子，将影响其在椎间盘突出症治疗中的作用。Zhou等[13]比较了乏白细胞血浆与富白细胞血浆处理肌腱干细胞的效果，发现乏白细胞血浆促进肌腱干细胞向成肌腱细胞分化的效果明显优于富白细胞血浆；而富白细胞血浆则可刺激肌腱干细胞向成肌腱细胞产生更多的分解代谢产物和炎症因子。本研究成骨分化实验中未对各组细胞分解代谢产物以及炎症因子进行观察，推测富白细胞血浆对细胞分化的抑制作用与血浆中白细胞产生的分解代谢产物以及炎症因子有关。

综上所述，乏白细胞血浆较富白细胞血浆在促进牙髓间充质干细胞成骨分化方面更具优势，临床修复骨缺损时建议使用乏白细胞血浆。