基于叶绿体DNA atpB-rbcL片段的典型樱亚属部分种的亲缘关系及分类地位探讨

朱 弘 伊贤贵 朱淑霞 王华辰 段一凡 王贤荣

(南京林业大学南方现代林业协同创新中心，生物与环境学院，热带森林生物多样性保护国家林业局重点实验室，南京 210037)

我国是现代樱属的分布中心之一，广泛分布于中国广阔的温带及亚热带区域，共计48种及10变种，其中33个种为特有分布[1]。俞德浚和李朝銮[2]依据腋芽单生和三芽并生进一步将该属划分为典型樱亚属(Subg.CerasusKoehne)和矮生樱亚属(矮李类)﹝Subg.Microcerasus(Koehne) Yu et Li﹞；其中典型樱亚属即为世人所熟知的樱花类植物，具有重要的生态价值、观赏价值、经济价值和文化价值。同时也被认为是樱属中较为进化的一个亚属，其下又细分9个组，对于研究蔷薇科系统演化具有重要的意义[3～4]。由于典型樱亚属植物分布广泛、生境多样，复杂地理气候影响以及因种间、种内存在频繁的天然杂交导致的网状进化，导致分化持续进行，在形态上表现出高度的连续变异性，加之该亚属植物花叶不同期的物候学特性，使得传统手段对其进行准确鉴别难度较大，从而限制了野生资源的认识与开发利用。为了对其进行更科学准确的分类，前人先后采用等位酶[5]、RFLP[6]、RAPD[7]、SSR[8]等不同类型的分子标记技术，开展了该亚属亲缘关系与分类学的研究，积累了一定的分子资料，然而部分分子证据与前人基于形态学等经典手段的观点存在出入。近年来，分子系统学特别是DNA测序技术的蓬勃发展有力的推动了该亚属植物的研究进程，例如Lee和Wen[9]基于ITS与Bortiri等[3,10～11]先后基于核基因ITS、s6pdh与叶绿体trnL-trnF、trnS-trnG多个片段的广义李属(PrunusL.)系统发育多个重建结果均表明，樱属是一个多系起源类群，其中典型樱亚属与稠李亚属(Subg.PadusMill)、桂樱亚属(Subg.LaurocerasusTourn. ex Duh.)在广义李属下构成单系分支。

叶绿体DNA具有高度的序列保守性、不受选择压力和独立的进化路线等特点，而非编码区相比编码区序列具有更高的碱基替换率，适合种属内及低阶元的亲缘关系和遗传多样性研究，近年来备受系统分类学家青睐[12]；其中atpB-rbcL序列位于编码ATP合成酶β基亚(atpB)基因和核酮糖1，5二磷酸羧化酶大亚基rbcL基因之间的非编码区域，拥有相对较多的有效信息位点，已经被广泛的应用于维管束植物系统发育的研究中[13～14]，尤其是在较低分类群的进化分析和鉴定，例如王华坤等[15]利用该区间研究了蔷薇科核果类果树的系统发育关系；此外，近年来有学者[16～17]基于该片段还发表了樱属新种。

典型樱亚属依然存在不少物种界定的问题，尾叶樱桃(C.dielsiana)种系就是其中一个突出的例子，原变种尾叶樱桃与种下短梗尾叶樱桃(C.dielsianavar.abbreviate)、长柱尾叶樱(C.dielsianavar.longistyla)，种间又与浙闽樱桃(C.schneideriana)等近缘种较难区分，而近年来陈子林等发表的樱属新种—磐安樱桃(C.pananensis)无疑又增加了该类群的争议和混淆，因此对该亚属种间亲缘关系及分类地位开展深入研究具有重要的理论和实际意义。鉴于上述情况，笔者采用广义李属的概念，着重典型樱亚属内取样，采用atpB-rbcL片段为代表的DNA条码的分子标记手段，主要目标在于：(1)验证该序列在典型樱亚属的低分类阶元鉴定中的可行性，从而为樱属及其近缘属植物DNA条码筛选提供参考；(2)结合前人发表序列，扩大典型亚属内的物种取样，从母系遗传背景上对典型樱亚属及其近缘物种进行种间关系的系统发育重建；(3)探讨尾叶樱桃(P.dielsiana)与长柱尾叶樱桃(P.dielsianavar.longistyla)及其与新发表的磐安樱桃(P.pananensis)等近缘种的分类地位，以期为典型樱亚属植物的分类地位与系统发生研究积累分子证据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

研究共涉及典型樱亚属7种(含1变种)。其中高盆樱桃(P.cerasoides)、尾叶樱桃、长柱尾叶樱桃为本研究新获得的15条序列，其新鲜幼嫩叶片为课题组于2017～2018年采自3个省4个县(市)的野生居群，由于尾叶樱桃分布零星，故选取3个县域的种源作为代表，而高盆樱桃和长柱尾叶樱桃分别为单个县域下单个代表居群，其居群内不同个体取样间距保持在30 m以上，采集地点信息及凭证标本号见(表1)；迎春樱桃(P.discoidea)、磐安樱桃、浙闽樱桃(P.schneideriana)和山樱花(P.serrulata)材料信息及对应的15条序列(JX84285～JX84291，JX84379～JX84383，JX847392～JX847394，JX847384)均引自Chen等[17]报道；此外，加入火棘(Pyracanthafortuneana)和水榆花楸(Sorbusalnifolia)各1条作为外类群，亦下载自GenBank的公共数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)。

表1 测序材料来源

1.2 基因组DNA提取与PCR扩增

取硅胶干燥的新鲜叶片0.65 g，用研钵与液氮研磨粉碎，采用天根(TIANGE)植物基因组试剂盒提取总DNA。通过质量体积分数1%的琼脂糖凝胶电泳和Tanon-2500全自动数码凝胶图像分析仪对DNA质量进行检测，将样品DNA保存至4℃冰箱，用于后续PCR实验。atpB-rbcL序列依据叶立新等[16]所述，正反引物分别为：5′-ACATCKARTACKGGACCAATAA-3′，5′-AACACCAGCTTTRAATCCAA-3′。PCR扩增体系为25 μL，其中含DNA模板2.0 μ·mol-1，上下游引物各1.0 μL，2×Taq Master Mix(天根)12.5 μL，8.5 μL ddH2O补齐。DNA扩增反应程序为：94℃预变性2 min，94℃变性1 min，52.2℃退火1 min，72℃延伸3 min，共30个循环，最后72℃延伸7 min。对PCR产物进行1%浓度琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格的样品送至南京金斯瑞生物科技公司进行纯化及测序，在ABI3730测序仪完进行单向测序。

1.3 数据处理

多序列比对(联配)、手工校正在Bioeditor 7.0.9软件[18]中及Clustal W模块完成；使用DNASP5软件[19]进行碱基组成、插入/缺失(indels)的序列特征分析，并统计确定单倍型(Haplotype)数量(H)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π)；再使用Network 5.003软件[20]基于最大简约性原则的中介邻接网络法(Median-Joining network，MJ)绘制不同单倍型间的进化网络图，插入/缺失处理为一次突变事件，在Adobe Illustrator CS6软件进行手工调整与布局优化；最后利用MEGA5软件[21]以邻接法(Neighbor Joining，NJ)、最大似然法(Maximum Likelihood，ML)与最大简约(Maximum parsimony，MP)3种算法构建系统发育树，并用自展法(Bootstrap)1 000次重复对系统发育树进行检测，标记在分支上。

2 结果与分析

2.1 PCR结果、序列特征

典型樱亚属3种PCR扩增产物经琼脂糖电泳抽样检测后(3个为1组)，在500～1 000 bp出现一清晰目的条带(图1)。测序后，将实验新增的15条序列与下载的15条序列进行比对、两端截齐，获得用于序列分析的30条序列矩阵全长为780 bp，在774个有效位点中共发现15个变异(多态性)位点(表2)，占分析序列的1.94%，其中简约信息位点14个，单一突变位点(SNP)1个，6个插入/缺失(位于1、339、341、680、767和777处)；(G+C)含量为29.50%，(A+T)含量为70.50%，存在明显的A-T偏好。将序列在NCBI上进行BLAST同源性检索，均有较好的匹配程度，确认所测序列为目标序列。

图1 引物atpB-rbcL的部分PCR扩增结果 1.高盆樱桃；2.尾叶樱桃；3.长柱尾叶樱桃Fig.1 Results of PCR amplification of partial atpB-rbcL primers 1.P.cerasoides; 2.P.dielsiana; P.dielsiana var. longisty

2.2 单倍型分布与中介邻接网络图的构建

在7个物种的30条序列中共检测到9个单倍型(表2，图2)，物种间平均单倍型多样性(Hd=0.880 5±0.026)，平均核苷酸多态性(π=0.007 11±0.000 54)；单倍型类型与物种存在良好的对应关系，其中尾叶樱桃拥有3个单倍型(Hap5～Hap7)，单倍型多样性最高，并与长柱尾叶樱桃(Hap8)以2个突变步数相连，在典型樱亚属中构成一个独立的分枝(蓝色虚线方框)；磐安樱桃(Hap4)位于中介网络图的躯干上，依次与mv1、mv2和mv3以1～2个突变步数相连，显示其较为原始的进化地位；迎春樱桃(Hap1)与之相距最远(相差4个突变步数)，独立进化成枝；其次为高盆樱桃(Hap3)和山樱花(Hap9)，分别相差3个突变步数和2个突变步数；浙闽樱桃(Hap2)与之距离最近(仅相差1个突变步数，在264 bp处存在碱基突变)，显示出较近的亲缘关系。

表2 atpB-rbcL片段9个单倍型的变异位点统计

注： *表示碱基与单倍型Hap1相同。

Note: * the same as the Haplotype 1.

2.3 系统发育树的比较和分析

为进一步阐明单倍型(Hap1～Hap9)的系统关系，本研究以水榆花楸和火棘为外类群分别构建NJ、MP和ML系统树(图3)。三个算法的拓扑结构基本一致：外类群(CladeⅠ)与典型樱亚属(CladeⅡ)形成两大分支。在典型樱亚属分枝中，又可分为4个独立组，其中迎春樱桃(Group D)与浙闽樱桃(Group C)各自构成2个组；高盆樱桃、山樱花、长柱尾叶樱桃和尾叶樱桃构成1个组(Group B)；磐安樱桃比较特殊，位于系统发育树基部，以梳齿状结构与其他种成为并系，没有得到很好的分化。

3 讨论

3.1 atpB-rbcL片段在典型樱亚属间分类中的应用评价

Network网络分析法能清晰地表明各单倍型间的关系(分布频率、基因流方向)，可以从DNA序列水平反应物种间的遗传多样性[22]。在中介邻接网络图中，除尾叶樱桃单倍型外(Hap5～Hap7)，不同种类物种均对应1个独特的单倍类型，具有较丰富的遗传多样性，这可能与本次实验的尾叶樱桃材料来源地多样(表1)有关，同时也表明atpB-rbcL序列在典型樱亚属种内保守，在种间不保守；在系统发育树构建中，相比笔者先前自测的ndhF或rbcL序列(未发表)仅能满足亚属间划分的分辨率需求，该片段序列提供的变异位点较多(6个位点发生了插入或缺失)，主要分支的支持度较高，因此可作为蔷薇科典型樱亚属系统发育重建提供较丰富的信息。王化坤等[4]就利用atpB-rbcL片段研究了樱桃(P.pseudocerasus)部分品种与其它核果类的演化顺序，平均变异率达到22/736=0.029 9，但分子进化速率在各物种间的分布不均匀。由于本研究仅使用了单个叶绿体片段对典型樱亚属下7个种进行了初步分析，虽然在部分种间具有显著的分子特征，存在无法完全将所有种分开的局限性，今后一方面可考虑增加核单拷贝基因及多片段组合进行联合建树分析，另一方面，对于消失的祖先单倍型(图2)，推测原因也可能与样本不足有关，应该加入更多典型樱亚属内所涉及物种材料及物种的群体分布地取样，以便得到更加准确有效的分析结果。

3.2 磐安樱桃分类地位的探讨

磐安樱桃[17]作为2013新发表的樱属新种，一直备受争议，有待更多的证据予以验证。外部形态特征上与浙闽樱桃、尾叶樱桃存在交叉和过渡，造成在实践中较难区分，例如，三者的共征在于全株毛被显著，在嫩枝、叶柄、叶脉(主脉和侧脉)、花梗均密被开展绒毛，萼片反折，花瓣先端2裂，且自然分布在华东(浙江、福建)有部分重叠；不同特征为磐安樱桃与尾叶樱桃的花萼长约为萼筒的2倍，而浙闽樱桃则是等长或稍长；磐安樱桃与尾叶樱桃花柱基部无毛、全株毛被均为黄棕色长柔毛，而浙闽樱为花柱基部有毛，全株毛被为灰褐色微硬毛等等；鉴于陈子林等在发表时，仅将浙闽樱桃与迎春樱桃作为相似种，与磐安樱桃进行分子建树比较；为了能够得到更加全面和客观的亲缘关系证据，在本研究中，笔者由此在典型樱亚属中增加了相似种尾叶樱桃种系(尾叶樱桃和长柱尾叶樱桃)以及远源分布的高盆樱桃，参考相同的引物序列及扩增体系获得序列进行系统发育树重建，结果显示：磐安樱桃置于系统树基部，可能处于较原始的进化阶段，但与浙闽樱桃、尾叶樱桃等其余物种构成并系，因而在分子层面上较难区分；而基于单倍型的中介邻接网络图进一步显示，磐安樱桃与浙闽樱桃突变步长最短，相比尾叶樱桃，两者具有更近的亲缘关系。

3.3 长柱尾叶樱桃分类地位的探讨

长柱尾叶樱桃是伊贤贵[23]在其2007年学位论文系统调查武夷山地区樱属资源基础上记录的新变种，与原变种尾叶樱桃的主要差别在于其花柱长约为雄蕊的2倍，且花粉外壁纹饰种间亦稍有差别；王贤荣在2014年出版的《中国樱花品种图志》[1]认为其与原变种的区别主要在于花柱明显长于花冠，亦将其整理收录。近年来，笔者在从事樱属专类调查研究时，又陆续在江西、安徽等地发现该种新分布地，遂将其一并采集与原变种进行比较分析。基于叶绿体单倍型Network中介网络图显示，长柱尾叶樱桃检测到一个单倍类型(Hap8)独立于原变种尾叶樱桃其余的3个单倍型，并与它们共同构成一独立进化单元；而基于叶绿体片段的系统发育树重建结果也表明，尾叶樱桃与长柱尾叶樱桃互为姊妹类群，且各支持度较高，因此，本研究从分子层面上支持上述学者的划分意见，即同意将长柱尾叶樱桃作为尾叶樱桃的变种处理。