汞离子功能核酸生物传感器的建立与应用

杜再慧 李相阳 田晶晶 田洪涛 许文涛

摘 要 利用汞离子（Hg2+）特异性功能核酸对Hg2+识别检测，其中模板主要包括与Hg2+特异性结合的识别区、形成G四链体的富G区以及由聚六乙二醇（Spacer18）链接的隔断区； 靶序列主要包括5'端配对区和3'端富T区。模板与靶序列只有在Hg2+存在的条件下才能结合并引发延伸，进而使富G序列在模板上剥离下来，但由于Spacer18的隔断作用导致富G序列以单链形式存在，在特定环境下形成具有过氧化物模拟酶活性的G-四链体，催化H2O2与2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（ABTS）发生肉眼可见的颜色变化，进而对Hg2+进行定量测定。利用构建的Hg2+功能核酸生物传感器，35 min内可完成检测，线性范围为20～500 nmol/L， 检出限达到16.5 nmol/L （3σ）。 实际水样中的加标回收率为98.5%～103.5%。本方法操作简单、成本低、耗时短，在应急处理、实时环境检测等方面具有良好的应用价值。

关键词 汞离子； G四链体； 间隔臂； 功能核酸； 生物传感器

1 引 言

汞 （Hg）是一种分布广泛的重金属，进入环境后很难降解，可通过生物富集作用在动物或人体内积累，对人体健康具有极大的危害[1～3]。生活饮用水卫生标准GB 5749-2006中规定Hg2+限量值为 1 mg/L[4]。建立一种廉价、快速、灵敏、特异性的Hg2+的检测方法是非常必要的。传统的Hg2+检测方法主要包括原子吸收光谱法（AAS）[5]、原子荧光光谱法（AFS）[6]等，方法灵敏、检出限低，但一般需要大型仪器和专业的操作人员，检测周期长，费用高。近年来，研究者不断开发出特异性金属离子功能核酸， 具有易于修饰、成本低、结构稳定、特异性强等优点[7，8]，使得Hg2+功能核酸生物传感器发展迅速[9]。

Hg2+能与富有胸腺嘧啶（T）的脱氧核苷酸链特异性结合形成稳定的双螺旋结构[10]，其结合强度超过正常的腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）配对。因此T-Hg2+-T错配可以作为一种良好的Hg2+识别元件。基于T-Hg2+-T错配可引起寡核苷酸链结构的变化、替换以及重组的原理建立的分析方法被广泛用于Hg2+的检测。近年来，在Hg2+与胸腺嘧啶相互作用的基础上，研究者采用电化学[11～13]、荧光[14，15]或者比色[16～18]作为信号输出方式， 建立了许多Hg2+检测方法。 其中，比色传感器具有无需分析仪器、肉眼可读、快速、容易操作等优点[19]，是Hg2+定点诊断、原位快速筛选的理想方法。最常见的比色传感器是通过氯高铁血红素（Hemin）和富G序列形成的具有过氧化物模拟酶（HRP）活性的G四链体，可以在H2O2存在的条件下催化2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（ABTS2-）发生颜色变化。

本研究以带有富G和隔断的序列为模板对Hg2+进行特异性检测，靶序列与模板序列同时含有6个连续T碱基的序列，不存在Hg2+时，两条序列不能结合，因此不发生延伸。当溶液中含有Hg2+时，靶序列与模板间通过T-Hg-T碱基错配形成稳定的双链结构， 在DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）和脱氧核糖核苷酸（dNTPs）存在的条件下发生延伸，但由于隔断序列的存在，富G序列只能从模板上剥离下来，以游离的单链形式存在。在K+、Hemin存在的条件下，形成具有过氧化物模拟酶活性的G四链体； 在H2O2存在的条件下，催化ABTS发生肉眼可见的颜色变化，通过颜色的变化可以对Hg2+进行定量检测。

4 结 论

利用Hg2+和胸腺嘧啶特异性结合形成T-Hg-T碱基错配，进而引发延伸反应，发生链置换，释放出单链富G序列，在K+和Hemin存在下形成具有过氧化物模拟酶活性的G-四链体，催化H2O2与ABTS发生肉眼可见的颜色变化，进而实现对Hg2+的定量檢测，建立了一种Hg2+比色传感器。此传感器设计简单、操作方便、检测时间短，结果肉眼可见，具有良好的灵敏度和选择性。检出限达到16.5 nmol/L（3σ），可以满足自来水样品中Hg2+的检测要求。

References

1 Boening D W. Chemosphere， 2000， 40（12）： 1335-1351

2 Nendza M， Herbst T， Kussatz C， Gies A. Chemosphere， 1997， 35（9）： 1875-1885

3 Leterme B， Blanc P ， Jacques， D. Environ.Sci.Pollut.Res.， 2014， 21（21）： 12279-12293

4 GB 5749-2006， Drinking Water Sanitary Standard. National Standards of the People's Republic of China

生活饮用水卫生标准. 中华人民共和国国家标准. GB 5749-2006

5 WANG Shuai， WANG Peng， WANG Xi-He， GAO Ji-Hui， ZHANG Zhi-Guo， WU Shao-Hua. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2009， 29（8）： 2262-2264

王 帅， 王 鹏， 汪细河， 高继慧， 张治国， 吴少华. 光谱学与光谱分析， 2009， 29（8）： 2262-2264

6 WANG Mei， LI Shan， ZHOU Jian-Dong， XU Ying， LONG Jun-Biao， YANG Bing-Yi. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2014， 34（8）： 2254-2258

王 梅， 李 姍， 周建栋， 徐 英， 龙军标， 杨冰仪. 光谱学与光谱分析， 2014， 34（8）： 2254-2258

7 Yang J， Dou B， Yuan R， Xiang Y. Anal. Chem.， 2016， 88（16）： 8218-8223

8 Zou M， Li D， Yuan R， Xiang Y. Biosens. Bioelectron.， 2017， 92： 624-629

9 Lee J S， Han M S， Mirkin C A. Angew. Chem. Int. Edit.， 2007， 119（22）： 4171-4174

10 Miyake Y， Togashi H， Tashiro M， Yamaguchi H， Oda S， Kudo M， Tanaka Y， Kondo Y， Sawa R， Fujimoto T. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128（7）： 2172-2173

11 Hong M， Wang M， Wang J， Xu X， Lin Z. Biosens. Bioelectron.， 2017， 94： 19-23

12 Xuan F， Luo X ， Hsing I M. Anal. Chem.， 2013， 85（9）： 4586-4593

13 Cai W， Xie S， Zhang J， Tang D， Tang Y. Biosens. Bioelectron.， 2017， 98： 466-472

14 Chiang C K， Huang C C， Liu C W， Chang H T. Anal. Chem.， 2008， 80（10）： 3716-3721

15 Huang J， Gao X， Jia J， Kim J K， Li Z. Anal. Chem.， 2014， 86（6）： 3209-3215

16 Nolan E M， Lippard S J. Chem.Rev.， 2008， 108（9）： 3443-3480

17 Kim H N， Ren W X， Kim J S， Yoon J. Chem. Soc.Rev.， 2012， 41（8）： 3210-3244

18 Ren W， Zhang Y， ChenH G， Gao Z F， Li N B， Luo H Q. Anal. Chem.， 2016， 88（2）： 1385-1390

19 Liu J， Cao Z， Lu Y. Chem. Rev.， 2009， 109（5）： 1948-1998

20 Kotch F W， Fettinger J C， Davis J T. Org. Lett.， 2000， 2（21）： 3277-3280

21 Chai F， Wang C， WangT， Ma Z ，Su Z. Nanotechnology， 2009， 21（2）： 025501

22 Cai W， Xie S， Zhang J， Tang D， Tang Y. Biosens.Bioelectron.， 2017， 98： 466-472

23 Ngernpimai S， Matulakun P， Teerasong S， Puangmali T， Kopwitthaya A， Kanokmedhakul S， Sangiamdee D， Chompoosor A. Sens. Actuators B， 2018， 255： 836-842

24 Xu H， Geng F， Jiang X， Shao C， Wang Y， Wang K， Qu P， Xu M， Ye B C. Sens. Actuators B， 2018， 255： 1024-1030

25 Li Y， Liu N， Liu H， Wang Y， Hao Y， Ma X， Li X， Huo Y， Lu J， Tang S. Sci. Rep.， 2017， 7： 45974-45982

26 Wang G， Xu G， Zhu Y and Zhang X. Chem. Commun.， 2014， 50（6）： 747-750

Abstract Excessive mercury ions have negative effects on individual health. So， it is of great significance to develop a method for rapid， sensitive and specific detection of Hg2+. In this study， the method for detection of Hg2+ was developed based on specific T-Hg-T mismatche and G-quadruplex. The template sequence mainly included the recognition region which could combine with Hg2+ specifically， the rich G region which could form G-quadruplex， and the speacer 18 partition zone. The target sequence mainly included 5' ends combining area and 3' end T-rich region. Templates and targets could be combined and the elongation was triggered only in the presence of Hg2+. Furthermore， the G-rich sequences were stripped off the templates and could form a single-stranded structure， because Spacer 18 had partition function. The G-quadruplex was formed with the K+ and hemin， and catalyzed H2O2-2，2-azinobis （3-ethylbenzothiozoline）-6-sulfonic acid（ABTS） reaction with color variations. The detection could be done within 35 min， and the Hg2+ concentration exhibited a linear correlation with absorbance at 414 nm within range of 20-500 nmol/L， with a detection limit of 16.5 nmol/L （3σ）. The recoveries of Hg2+ spiked in tap water were 98.5%-103.5%. The method exhibited the advantages such as simple operation， low cost and short time， and operation value in emergency treatment and real-time environmental detection.

Keywords Mercury ion ； G-quadruplex； Spacer arm； Functional nucleic acid； Biosensor

（Received 5 November 2017； accepted 8 March 2018）