17个枸杞品种的SCoT遗传多样性

马利奋，尹 跃，赵建华，王亚军，戴国礼，安 巍，*

(1.宁夏枸杞产业发展中心，宁夏 银川 750001； 2.宁夏农林科学院 国家枸杞工程技术研究中心，宁夏 银川 750002)

枸杞(LyciumbararumL.)系茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)，多年生落叶灌木植物。全球约有80个种，在全球呈离散分布，主要分布在欧亚大陆、非洲南部、北美洲南部和南美洲南部；中国有7个种和3个变种。中国枸杞栽培面积稳居世界第一[1-2]。从枸杞种质资源的收集保存数量上来看，中国处于世界领先地位，丰富的种质资源为枸杞的遗传改良和新品种培育提供了丰富的材料。目前，已选育审定了20多个枸杞品种[3]，主要采用群体选优和常规杂交育种方式，如宁杞1号、宁杞2号和宁杞4号都是从农家品种大麻叶生产园选育的。枸杞具有自交不亲和、基因组杂合度较高等特点，自然选择使得枸杞遗传背景极其复杂，品种间的亲缘关系不明确。同时，不同枸杞产区枸杞品种引种比较频繁，导致同物异名、同名异物的现象普遍存在。因此，对枸杞品种资源遗传多样性研究极为重要。

随着DNA分子标记技术的发展，基于PCR技术的分子标记在种质资源遗传多样性研究中得到广泛应用。目前，RAPD[4]、SSR[5-6]、SRAP[7]和ISSR[8]等标记已应用于枸杞种质资源遗传多样性研究。目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism，SCoT)标记是一种基于PCR技术的新型显性分子标记，由Collard等[9]提出，最早应用于水稻，是根据植物基因组中ATG翻译起始位点侧翼序列的保守型，设计单引物对基因组区域进行扩增，产生偏向候选功能基因区的显性多态性标记。Pratik等[10]利用24条SCoT引物对5个居群的155份苎麻进行遗传多样性和群体结构分析，结果显示印度苎麻群体SCoT多态性较高(>50%)，遗传差异大(GST=0.27)。Que等[11]选用20条SCoT引物对107份甘蔗进行遗传多样性分析，多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)平均值为0.861，遗传多样性丰富。Jiang等[12]采用24条SCoT引物对95份鸭茅进行遗传多样性分析，扩增检测到多态性条带数228条，多态性比率为83.4%。Huang等[13]利用7条SCoT引物构建了6个牛鞭草栽培品种的DNA指纹图谱。杨祥燕等[14]利用SCoT标记对22个番木瓜主要栽培品种进行遗传多样性分析和指纹图谱构建，其中6个SCoT标记可将22个品种完全区分开。利用SCoT标记技术对枸杞进行遗传多样性研究的文献较少，查美琴等[15]利用SCoT标记对新疆枸杞种质资源遗传多样性进行研究，9条SCoT引物扩增检测到219条多态性条带，多态性比率为85.62%；UPGMA聚类分析将30份种质分为2大类和4个亚类。本研究利用SCoT分子标记技术，对17个枸杞品种进行遗传多样性分析，旨在从DNA水平上揭示枸杞品种的亲缘关系及遗传特性，以期为枸杞新品种选育、亲本选配、品种资源保护等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

17个枸杞主要栽培品种(表1)，均采自于宁夏农林科学院国家枸杞工程技术研究中心枸杞种质资源圃(38°38′49″N，106°9′10″E)。其中，宁杞菜1号和天精3号为菜用品种，其余品种均为果用品种。于2016年5月采集幼嫩叶片保存在液氮中，带回实验室置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 仪器及试剂

主要仪器有冷冻研磨仪(MM400，德国Retsch)、台式高速冷冻离心机(5810R，德国Eppendorf)、核酸蛋白检测仪(BioPhotometer Plus，德国Eppendorf)、PCR仪(PTC-200，美国Bio-Rad)、水平电泳仪(DYY-10C，北京六一)和全自动凝胶成像仪(AlphaImager HP，美国Alpha Inotech)。试剂主要有基因组DNA提取试剂盒、DL 2 000 Marker、2×TaqPlus Master mix、琼脂糖凝胶和50×TAE缓冲液，以上试剂均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取与检测

枸杞叶片DNA提取采用天根基因组DNA试剂盒(DP320-02)，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白仪检测其质量和浓度，将符合实验要求的DNA稀释至50 ng·μL-1工作浓度，保存-4 ℃冰箱用于后续PCR实验。

1.3.2 SCoT引物筛选

80条SCoT引物序列参考文献[9]，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。选用表型性状差异较大的4个品种，宁杞1号、宁杞5号、宁杞菜1号和天精3号进行多态性引物的筛选(表2)。

1.3.3 SCoT-PCR扩增

PCR反应体系25 μL：DNA模板1 μL(50 ng·μL-1)，引物1.7 μL(10 μmol·L-1)，2×TaqPlus Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.8 μL。SCoT-PCR扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

表1供试17个枸杞品种

Table1Seventeen goji (wolfberry) cultivars used in this study

序号No.品种名称Cultivar names选育单位Breeding institutes类型Type1宁杞1号Ningqi 1宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar2宁杞2号 Ningqi 2宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar3宁杞3号 Ningqi 3宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar4宁杞4号 Ningqi 4宁夏中宁县枸杞产业管理局Ningxia, Zhongning of Wolfberry Industry Authority果用品种 Fruit cultivar5宁杞5号 Ningqi 5宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar6宁杞6号 Ningqi 6宁夏林业研究所股份有限公司Ningxia Forestry Institute Co., Ltd.果用品种 Fruit cultivar7宁杞7号 Ningqi 7宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar8宁杞菜1号 Ningqicai 1宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences菜用品种 Vegetable culti-var9宁农杞1号 Ningnongqi 1宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar10宁农杞2号 Ningnongqi 2宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar11宁农杞3号 Ningnongqi 3宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar12宁农杞9号 Ningnongqi 9宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar13蒙杞1号 Mengqi 1内蒙古农牧科学院Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Sciences果用品种 Fruit cultivar14天精3号 Tianjing 3河北科技师范学院 Hebei Normal University of Science &Technology菜用品种Vegetable culti-var15大麻叶 Damaye宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar16小麻叶 Xiaomaye宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar17白花 Baihua宁夏农林科学院Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences果用品种 Fruit cultivar

表2十九条SCoT引物序列及其扩增多态性结果

Table2Sequence and polymorphism information of 19 SCoT primers

引物名称Primer name引物序列(5'—3')Primer sequence总条带数Total numberof bands多态性条带数Number ofpolymorphic bands 多态性百分率Percent bandpolymorphism/%多态信息含量PICSCoT-21ACGACATGGCGACCCACA5480.000.108SCoT-24CACCATGGCTACCACCAT88100.000.135SCoT-25ACCATGGCTACCACCGGG3266.670.106SCoT-29CCATGGCTACCACCGGCC4250.000.055SCoT-30CCATGGCTACCACCGGCG5360.000.116SCoT-31CCATGGCTACCACCGCCT5240.000.064SCoT-32CCATGGCTACCACCGCAC5480.000.177SCoT-41CAATGGCTACCACTGACA3266.670.106SCoT-48ACAATGGCTACCACTGGC8787.500.109SCoT-49ACAATGGCTACCACTGCG5480.000.199SCoT-55ACAATGGCTACCACTACC5360.000.233SCoT-58ACAATGGCTACCACTAGG7571.400.133SCoT-64ACCATGGCTACCACGGTC5360.000.127SCoT-65ACCATGGCTACCACGGCA3266.670.106SCoT-66ACCATGGCTACCAGCGAG8787.500.239SCoT-72CCATGGCTACCACCGCCC6466.670.104SCoT-73CCATGGCTACCACCGGCT33100.000.111SCoT-76CCATGGCTACCACTACCG44100.000.159SCoT-78CCATGGCTACCACTAGCA4250.000.125总数Total9671平均Average5.053.7473.960.132

PCR扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 数据分析

根据PCR扩增产物的电泳结果，在凝胶的相同迁移位置上有条带记为“1”，无条带记为“0”，只统计扩增清晰的条带，建立SCoT标记的(0，1)数据矩阵。利用GD calculation[16](http://plantmolgen.iyte.edu.tr/GDdom/)计算多态信息含量。采用NTSYSpc-2.1软件[17]的SIMQUAL模块计算简单匹配(simple matching，SM)系数，SHAN模块非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 ScoT扩增多态性

从80条SCoT引物中筛选出19条稳定性好、扩增条带清晰、多态性高的引物。用这19条引物对17个枸杞品种基因组DNA进行SCoT扩增，共扩增到96个条带；其中，多态性条带71条，多态性比率73.96%，平均每对引物可扩增出多态性条带3.74条，多态信息含量变化范围为0.055(SCoT-29)～0.239(SCoT-66)，平均为0.132(表2)。引物SCoT-24和SCoT-55对17个枸杞品种PCR扩增电泳结果见图1和图2。

2.2 遗传相似性分析

根据19条多态性SCoT引物对供试枸杞品种的扩增结果，利用NTSYS-pc软件计算品种间的遗传相似系数。结果(表3)显示，17个枸杞品种间的相似系数为0.43～1.00，平均为0.86，其中大麻叶和小麻叶遗传相似系数最大(1.00)，说明它们之间的亲缘关系较近。相似系数最小(0.43)的是蒙杞1号与天精3号，说明它们之间的亲缘关系较远。相似系数分布在0.72～1.00的品种占总数的88.24%，相似系数小于0.72的品种仅占11.76%。结果说明，供试枸杞品种的遗传相似性较高，遗传多样性较低。

M，DL 2 000 marker；1～17，材料编号同表1。M，DL 2 000 marker; 1-17，Material codes were the same as table 1.图1 引物SCoT-24(A)和SCoT-55(B)的PCR扩增图谱Fig.1 PCR amplification profile of primers SCoT-24 (A) and SCoT-55 (B)

表3十七个枸杞品种间的遗传相似系数

Table3The genetic similarity coefficients for 17 goji (wolfberry) cultivars

序号No.123456789101112131415161711.0020.921.0030.920.921.0040.890.930.891.0050.890.910.930.901.0060.890.910.930.920.921.0070.910.990.910.920.900.901.0080.800.820.800.830.790.810.811.0090.900.900.940.870.930.950.890.781.00100.900.920.940.910.970.930.910.800.921.00110.930.970.930.920.920.920.960.810.930.931.00120.910.910.950.920.920.940.900.810.930.930.921.00130.900.900.940.910.910.950.890.800.960.920.910.971.00140.470.490.450.480.440.460.480.590.450.450.480.440.431.00150.960.960.960.930.930.930.950.840.940.940.970.950.940.491.00160.960.960.960.930.930.930.950.840.940.940.970.950.940.491.001.00170.880.880.920.870.930.890.890.760.920.920.890.910.900.470.920.921.00

1～17，材料编号同表1。

1-17，Material codes were the same as table 1.

2.3 聚类分析和主坐标分析

利用UPGMA法构建17个枸杞品种的聚类图。从聚类图(图2)可以看出，在遗传相似系数阈值为0.87处，可将17个枸杞品种分成3大类。第Ⅰ大类包括15个品种：宁杞1号、宁杞2号、宁杞7号、宁农杞3号、大麻叶、小麻叶、宁杞4号、宁杞3号、宁农杞9号、蒙杞1号、宁杞6号、宁农杞1号、宁杞5号、宁农杞2号和白花枸杞，它们均是果用品种。第Ⅱ大类和第Ⅲ大类各包括1个品种，分别为宁杞菜1号和天精3号，它们均是菜用枸杞品种。

基于遗传相似性系数对供试枸杞品种进行主坐标分析，结果(图3)显示，第一主坐标和第二主坐标解释了44.2%和21.3%的品种间相关性。主坐标分析的划分结果与聚类分析结果高度一致，将位置靠近的枸杞品种划分在一起，可明显分为3大类(Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ)。主坐标分析更能直观清楚地显示供试枸杞品种间的亲缘关系。

图2 基于SCoT标记的17个枸杞品种聚类分析图Fig.2 UPGMA dendrogram of 17 wolfberry cultivars based on SCoT markers

图3 基于SCoT标记的17个枸杞品种主坐标分析图Fig.3 Principal coordinated analysis of 17 goji (wolfberry) cultivars based on SCoT markers

3 讨论

枸杞品种选育方式主要是基于群体选优，由于骨干亲本重复利用，使得品种形态特征相似，利用形态特征辨别耗时费力。基于PCR基础的DNA分子标记技术不易受环境、时间等影响，已成为枸杞品种遗传多样性研究的重要技术手段。本研究利用19条SCoT引物对17个枸杞品种进行扩增，共扩增到96个条带，其中多态性条带71条，多态性比率为73.96%。多态信息含量为0.055～0.239，平均为0.132。Ntsys-pc软件计算17个枸杞品种间遗传相似系数为0.43～1.00。UPGMA聚类分析显示，在遗传相似系数为0.87处，可将17个枸杞品种分为3大类。17个枸杞品种的遗传相似性较高，遗传多样性较低，这与SSR标记研究结果相一致[18]，11对SSR引物检测12个枸杞品种，遗传相似系数为0.57～0.91，PIC平均值为0.391。2种标记(SCoT和SSR)PIC值均小于0.5，但SSR标记PIC值大于SCoT标记。说明目前选育的枸杞品种遗传相似性较高，遗传多样性低。