猪传染性胸膜肺炎的实验分析

贾荣玲

摘 要 为了减少猪传染性胸膜肺炎给养猪业带来的经济损失，本试验对某猪场送检病料采取细菌分离、培养、镜检、PCR鉴定、动物试验和药敏试验等一系列措施，诊断该病料中的胸膜肺炎放线杆菌为该病的病原。药敏试验表明，头孢噻呋钠、磺胺嘧啶和恩诺沙星为治疗该病的首选药物，能够为规模化猪场传染性胸膜肺炎病的科学防控和合理用药提供科学参考。

关键词 猪传染性胸膜肺炎；诊断；防治

中图分类号：S858.28 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.18.073

猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的一种高度传染性呼吸道疾病，2～5月龄的种猪和育肥猪最易感，以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为主要特征。河南省周口市某猪场的育肥猪，于2017年3月25日开始发病，出现死亡病例。病猪症状为。1）发病急。发病单元猪咳嗽症状比例为3%～5%，部分发病猪死亡前有呕吐症状，然后突然死亡。2）体温升高。测量6头，5头体温在39.6～39.8 ℃，1头41.6 ℃。3）病死率高。发病单元病死率严重的能达到15%（5%～15%）。4）发病易反复。育肥舍53～58单元批次，从2107年4月6日开始发病，用药稳定后，出现反复，进入后备批次仍然发病，最终损失106头。本试验通过对细菌的分离鉴定和药敏实验，对来自该猪场的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌进行血清型鉴定和耐药性测定，为公司对自家苗的研发、耐药性监测和防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料的来源

某猪场送检的疑似患有猪传染性胸膜肺炎的肺脏8份，而且是具有该病典型病变特征的肺脏。采样要求：无菌采集死亡2 h以内猪的完整肺脏（连带气管），装入密封的样品袋中，在4 ℃条件下保存送检。

1.1.2 实验动物

健康小白鼠10只。

1.1.3 主要仪器设备

电热恒温培养箱（DHP-系列），上海一恒科学仪器有限公司；微型台式离心机（TDL-80-2B），上海安亭科学仪器厂；光学显微镜（BM XSP-BM-2CE），上海彼愛姆光学仪器制造有限公司；实体显微镜（XTL-6013J4型），苏州倍特嘉光电科技有限公司；PCR扩增仪（T960），杭州晶格科学仪器有限公司；琼脂糖水平电泳槽（HE-120），天能科学仪器生产商；恒压恒流电泳仪（EPS-300），天能科学仪器生产商；全自动凝胶图像分析系统（Champ Gel 5000），北京赛智创业科技有限公司；空气浴震荡培养箱（ZHWY-100C），上海一恒科技有限公司；高速冷冻离心机（GL21M），长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.1.4 主要试剂

脑-心浸萃液态培养基，购于广东微生物科技有限公司；NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），由ROCHE上海如吉生物科技提供；TSA培养基（终浓度50 ?g·mL-1 +10%马血清），其中TSA培养基来自BD，购自上海樊克生物科技有限公司；马血清，购自郑州九龙生物制品有限公司；PCR反应试剂、pMD18-Tvector购自大连宝生物工程有限公司；药敏片由兽医研发中心自制。

1.1.5 引物的设计与合成

通用引物序列分别为APP-F：GCTCACCAACGTTTGCTCAT、APP-R：GGGGACGTAACTCGGTGATT，扩增的片段大小为

377 bp，退火温度58 ℃，扩增基因apxIV，由郑州赛斯生物科技有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离培养

将送检来的病料处理后接种于TSA（终浓度

50 ?g·mL-1+10%马血清）培养基，置37 ℃恒温培养箱24 h[1]，因菌株培养特性不一，接种6 h后，每隔2 h观察

1次，发现平板长出肉眼可见的菌落后，将其取出，挑取形态大小疑似APP的菌落，接种到新的TSA培养基上进行传代纯化[2]。

1.2.2 实体显微镜下观察结果

病原分离后在培养皿上培养18～24 h，直接将培养皿放在实体显微镜下观察。

1.2.3 光学显微镜下观察

用接种环调取菌落的纯培养物于玻片上，经过火焰固定后使用革兰氏染色方法染色，染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干，然后在光学显微镜下使用100倍油镜观察。

1.2.4 PCR鉴定

挑取单个菌落接种于TSA培养基（TSA）中，在

37 ℃的环境中培养18～24 h。吸取100 ?L菌液于1.5 mL的离心管中，转速10 000 r·min-1，离心3 min，弃上清，加入50 ?L超纯水混匀（菌体），在100 ℃的水中煮

10 min。转速为10 000 r·min-1，离心10 min。上清即为所需的DNA模板，在-20 ℃的环境中保存备用。

在PCR管中依次加入PCR Mix 12.5 ?L、双蒸水

10 ?L、上、下游引物各1 ?L、模板2 ?L，挑配好扩增体系，混匀，瞬时离心30 s后放入扩增仪中。95 ℃预变性

5 min，在54 ℃的环境中退火30 s、在72 ℃的环境中退火30 s，30次循环；在72 ℃的环境中延伸10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳（90 V，30 min），电泳结果用凝胶成像仪拍照观察。

1.2.5 动物试验

本次将10只健康小白鼠随机分为两组（每组5只），一组腹腔注射无菌的PPLO液体培养液（空白组），另一组接种培养好的菌液（试验组）。饲养于动物房中，经过24 h后观察[3]。

1.2.6 药敏试验

将含有抗菌药物（青霉素、头孢噻呋钠、庆大霉素、林可霉素、土霉素、磺胺嘧啶、多西环素、恩诺沙星、阿莫西林、安普霉素、黏菌素、新霉素、氟苯尼考、链霉素）的药敏片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，置37 ℃恒温箱中培养18～24 h后观察结果。按胸膜肺炎放线杆菌的抑菌圈直径大小（mm）作为判定敏感度高低的标准，根据NCCLS标准：0 mm<抑菌圈直径

≤10 mm，低敏；10 mm<抑菌圈直径≤15 mm，中敏；抑菌圈直径>15 mm，敏感[3]。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离培养结果

某猪场分离到的病原菌在TSA培养基中呈圆形、隆起、表面光滑、边緣整齐的半透明小菌落，如图1所示。

2.2 实体显微镜的观察结果

在45°折射光下用实体显微镜观察，菌落具有鲜明的金红带蓝色荧光，结构细致，菌落上面似有一层白色云雾，远端较浓厚，如图2所示。用接种丝不容易刮下，对培养基有蚀刻性。

2.3 光学显微镜下的观察结果

病原菌在10×100倍油镜下，镜检为革兰氏阴性小球杆状，两极浓染，无芽孢和鞭毛，有荚膜，如图3所示。

2.4 PCR检测结果

以分离到的6株病原菌核酸提取物为模板，使用猪胸膜肺炎放线杆菌特异性引物App-F/App-R扩增出约377 bp的阳性条带，表明6株细菌均为猪胸膜肺炎放线杆菌。PCR电泳结果如图4所示。

2.5 动物试验

实验组的5只小白鼠在注射后24 h内全部死亡。解剖死亡小白鼠，发现肺部严重出血，采取肺脏组织分离培养，经染色涂片可见革兰氏阴性小杆菌，结果说明肺脏部位分离出来的APP比较纯，为致病菌。

2.6 药敏试验

极敏感的药物有头孢噻呋钠、磺胺嘧啶和恩诺沙星，不敏感的药物有青霉素、链霉素、阿莫西林和安普霉素，中度敏感的药物有庆大霉素、林可霉素、土霉素、多西环素、黏菌素、新霉素、氟苯尼考，结果见表1。

3 讨论与小结

通过细菌分离，对分离细菌进行培养观察，以及PCR鉴定，说明该细菌为胸膜肺炎放线杆菌。通过动物试验表明该革兰氏阴性菌致病性非常强，也符合该细菌的致病特征。通过药敏试验及药物防治，发现头孢噻呋钠、恩诺沙星，磺胺嘧啶有很好的防治效果，氟苯尼考也有一定的疗效，但比头孢噻呋钠要稍差些，但是在实践中经常使用上述药物的养殖场，有可能出现与本实验不相符的现象。

相关研究表明，猪传染性胸膜肺炎主要发生在春季，常发于在12～25周龄的猪。随着养猪业规模化、集约化的发展，引种日益频繁，距离也越来越远，导致猪场疾病越来越复杂，病毒、细菌等多病原混合感染的现象越来越多，给疫病防控工作带来了很大的难度。预防和控制猪传染性胸膜肺炎除了疫苗、抗生素以外，加强饲养管理、实行综合防控措施提高机体免疫力是必须与可行的。

参考文献：

[1] 周信荣，宋德平，彭棋，等.猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、毒力基因检测及药敏试验[J].动物医学进展，2016，37（1）：67-71.

[2] 宋勇.猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及NqrA-ELISA方法的建立[D].雅安：四川农业大学，2012.

[3] 于桂阳.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离培养及药敏试验[J].畜禽业，2008（3）：56-57.

（责任编辑：赵中正）