醛酮还原酶AKR7A3原核表达条件的优化及酶学活性检测

孙婷婷，孙基丰，周紫薇，褚春旭，张昊

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

AKR作为NADPH依赖的氧化还原酶[1]家庭成员当中的一种，AKR家族的存在十分广泛，在原核和真核生物当中都存在该种类型的酶[2]。文献表明人源AKR家族种类已发现了15个[3]AKR酶家族主要参与生物机体内醛酮类化合物的代谢过程，并在醛类和相关化合物的解毒时期发挥着不可忽视的作用。AKR家族酶的底物主要有脂肪族和芳香族的醛/酮类的化合物[4]。所以该酶在生成激素、药物的分解排出、炎症反应、解毒等生物活动中有着不可忽视的作用[5]。AKR大多以37kDa的单体类型出现在细胞浆中[6-8]。不同种类间的分布以及作用是不一样的，比如说AKR6家族能够控制K+通道的开放，AKR1、AKR6、AKR7三个种类在哺乳动物机体中均有表达，其功能是参加生物的生命代谢过程[9]。有关报道显示，AKR7亚类型中的成员AKR7A2和AKR7A3主要参加肝脏对黄曲霉毒素的解毒的过程，其中AKR7A3主要是参与肝脏中AFB1类的毒性解除作用[10]。但是关于AKR7A3酶学活性的相关研究很少。

大肠杆菌是科研实验中最常用的高效表达异源蛋白的原核表达工具，其优点在于操作简便，培养条件简单[11]。但并不是所有外源遗传物质都能够在这种表达体系中进行有效表达[12]，主要由于不同的遗传物质有不同构造、mRNA的稳定性[13]、翻译、折叠、宿主细胞蛋白酶的降解作用，大肠杆菌密码子在原核和真核基因使用上的区别，以及蛋白质对宿主的产生相对的毒性[14]等因素。因此，本文对于人源AKR7A3基因序列进行相应的密码子优化，构建原核表达体系，优化表达条件，获得最大产量的可溶性酶蛋白，再通过酶促动力学实验，获得最优酶活性条件。本文实验结果将为后续AKR7A3研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 AKR7A3基因合成

从GENE BANK里面获取AKR7A3全序列，选取相应酶切位点，由上海生工合成并优化得到AKR7A3-pET15b质粒。

1.2 菌株和试剂

大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21（DE3），由本实验室制备并保存；IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）配成100mg/mL浓度备用。低相对分子质量蛋白Marker和SDS-PAGE试剂购自宝生物工程大连公司（进口分装）；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 AKR7A3原核表达

将重组质粒AKR7A3-pET15b和pET 15b空载体分别进行诱导表达，于37℃培养至OD600约为0.6，加入IPTG诱导5h。菌体离心后弃上清，得到的菌体沉淀用100μL PBS重悬后进行分离纯化。蛋白样品分别加入100μL 2×SDS PAGE上样缓冲液，沸水中处理5min，12000rpm/min瞬时离心后取20μL上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。以pET 15b空载体和未加IPTG的AKR7A3-pET15b菌为对照鉴定目的基因AKR7A3的表达情况。

1.4 温度对重组菌AKR7A3表达的影响

BL21-pET15b-AKR7A3在转速180rpm、5h、诱导剂终浓度为1mM/L条件不变，温度分别为37℃、30℃、24℃、16℃的环境下进行表达。将其菌体进行收集、超声破碎，将得到的上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.5 转速对重组菌AKR7A3表达的影响

BL21-pET15b-AKR7A3在温度 37℃，5h，诱导剂终浓度为1mM/L条件不变，转速分别为110rpm、130rpm、150rpm、180rpm的条件下进行表达。将其菌体进行收集、超声破碎，离心使用上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.6 时间对重组菌AKR7A3表达的影响

BL21-pET15b-AKR7A3在37℃、180rpm，诱导剂终浓度为1mM/L条件不变，表达时间分别为5h、10h、16h、20h的条件下进行表达。将其菌体进行收集、超声破碎，离心使用上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.7 诱导剂浓度对重组菌AKR7A3表达的影响

BL21-pET15b-AKR7A3在37℃、180rpm，5h条件不变，诱导剂终浓度分别为0.40mM/L、0.60mM/L、0.80mM/L、1.00mM/L环境下进行表达。将其菌体进行收集、超声破碎，离心使用上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.8 醛酮还原酶AKR7A3酶活性动力学检测

1.8.1 最佳反应温度确定

酶反应体系300μL；DL-甘油醛作为底物；NADPH作为体系辅酶；2%的乙腈为共溶剂；100mM/L PBS为反应的缓冲溶液；PH需要控制在7.0；设置反应温度为20℃、25℃、30℃、37℃以及40℃，反应时间达到5分钟，反应后在340nm处测定吸光数值。

1.8.2 最佳反应PH值确定

酶反应体系300μL；DL-甘油醛为底物；NADPH作为体系辅酶；2%的乙腈为共溶剂；100mM/L PBS为反应的缓冲溶液；反应温度设置为37℃；将其PH值设置为5.00、6.00、7.00、8.00以及9.00，反应时间达到5分钟，反应后在340nm.处测定吸光数值。

1.8.3 最佳反应NADPH辅酶浓度确定

酶反应体系300μL；DL-甘油醛为底物；NADPH作为体系辅酶；2%的乙腈为共溶剂；100mM/L PBS为反应的缓冲溶液；反应温度为37℃；PH设置为7.00，NADPH辅酶浓度设置为0.10mmol/L、0.15mmol/L、0.20mmol/L、0.30mmol/L、0.40mmol/L，反应时间达到5分钟，反应后在340nm处测定吸光数值。

1.8.4 最佳反应底物浓度确定

酶反应体系300.00μL；DL-甘油醛为底物；NADPH作为体系辅酶；2%的乙腈为共溶剂；使用100mM/L PBS作为反应的缓冲溶液；反应温度为37℃；PH控制在7.0；底物浓度分别为2.00mmol/L、4.00mmol/L、 6.00mmol/L、 8.00mmol/L、10.00mmol/L，反应时间达到5分钟，反应后在340nm处测定吸光数值。

1.8.5 最佳加酶量确定

酶反应体系300μL；DL-甘油醛为底物；NADPH作为体系辅酶；2%的乙腈为共溶剂；100mM/L PBS作为反应的缓冲溶液；反应温度为37℃；PH控制在7.00；酶的用量分别为16ng、40ng、64ng、80ng、96ng几个梯度，反应时间达到5分钟，反应后在340nm处测定吸光数值。

1.8.6 最佳反应底物确定

酶活反应体系300uL；DL-甘油醛作为底物；NADPH作为体系辅酶；2%的乙腈作为共溶剂；100mM/L PBS作为反应的缓冲溶液；反应温度为37℃；PH控制在7.0；底物分别为睾丸酮、孕酮、DL-甘油醛、雌二醇、甲睾酮、雌酮，反应时间达到5分钟，反应后在340nm处测定吸光数值。

2 结果与分析

2.1 BL21-pET15b-AKR7A3表达菌构建结果

图1 BL21-pET15b-AKR7A3质粒鉴定

图1中可以看出，M为15000marker，1泳道为空的pET-15b载体，其余条带均比1泳道高。证明在氨苄青霉素平板上挑选的单菌落均成功转入pET15b-AKR7A3质粒，并说明AKR7A3的表达载体已成功构建，能用于后续实验。

2.2 AKR7A3蛋白表达结果

图2中可以看出，M为15000marker，1泳道为BL21-pET15b-AKR7A3表达菌的上清液，其中目的蛋白醛酮还原酶AKR7A3大量表达，其大小约为36kDa。4泳道为NPI-1流出液，其中无目的蛋白条带，说明醛酮还原酶AKR7A3与镍柱充分结合。2，3泳道为洗脱后流出液，其中3泳道无杂蛋白，蛋白纯度能够达到99%。

图2 AKR7A3蛋白表达SDS-PAGE电泳图

2.3 表达温度优化结果

在图3中可以看出，醛酮还原酶AKR7A3在温度为37℃、30℃、24℃、16℃环境下的表达情况。其中4泳道温度为16℃，其上清中醛酮还原酶AKR7A3表达量是最多的。

图3 温度优化结果

2.4 表达转速优化结果

图4中可以看出，醛酮还原酶AKR7A3在转速分别为110rpm、130rpm、150rpm、180rpm条件下的表达情况。1泳道是转速为110rpm，上清中的醛酮还原酶AKR7A3表达量最多。

图4 转速优化结果

2.5 表达时间优化结果

在图5可以看到，醛酮还原酶AKR7A3表达时间分别为5h、10h、16h、20h条件下的表达情况。其中4泳道为20h，上清中的醛酮还原酶AKR7A3表达量是最多的。

图5 表达时间优化结果

2.6 诱导剂IPTG浓度优化结果

在图6中可以看到，醛酮还原酶AKR7A3在诱导剂终浓度分别为0.40mM/L、0.60mM/L、0.80mM/L、1.00mM/L条件下的表达情况。4泳道诱导剂浓度为1.0mM/L，上清中的醛酮还原酶AKR7A3表达量是最多的。

图6 表达时间优化结果

2.7 醛酮还原酶AKR7A3酶活性检测

从温度、PH、底物、NADPH、酶量等因素优化来看，测得最佳动力学参数如下：

在不同温度（20℃、25℃、30℃、37℃、40℃）下检测AKR7A3酶活力，结果表明在37℃时酶活力最高，如图7（a）。在不同PH值（5.00、6.00、7.00、8.00、9.00）下检测AKR7A3酶活力，结果表明在PH=7酶活力最高，如图7（b）。不同NADPH浓度（0.10、0.15、0.20、0.30、0.40mmol/L）下检测AKR7A3酶活力，结果表明在0.2mmol/L时酶活力最高，如图7（c）。在底物不同浓度（2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mmol/L）下检测AKR7A3酶活力，结果表明在2.00mmol/L时酶活力最高，如图7（d）。在不同加酶量（16.00ng、40.00ng、64.00ng、80.00ng、96.00ng）下检测AKR7A3酶活力，结果表明在100μL时酶活力最高，如图7（e）。在不同种类反应底物下检测酶活力，结果表明睾丸酮＞雌酮＞孕酮＞甲睾酮＞DL-甘油醛，但是在雌二醇为底物时醛酮还原酶检测AKR7A3酶活力显著小于其他底物，原因是由于雌二醇中没有醛基/酮基，无法在醛酮还原酶的作用下进行相关反应。如图7（f）。

图7 最佳酶活性确定

综上所述，在 37℃；PH=7；NADPH 浓度0.2mmol/L；底物浓度2.00mmol/L；加酶量100μL；睾丸酮为底物时酶活力最高。

3 结论

本文为了能够使得人源醛酮还原酶AKR7A3在该大肠杆菌BL21中正常表达，在GEN BANK中查找人源AKR7A3基因序列，依照大肠杆菌表达的相关特征，对人源基因序列进行密码子的相应优化。合成优化后的醛酮还原酶AKR7A3基因序列，构建了AKR7A3-pET15b载体。使用大肠杆菌BL21作为宿主菌进行表达，并对AKR7A3表达的温度、转速、表达所需时间和诱导剂浓度等表达条件进行优化。实验得到最优的表达条件为16℃、110rpm/h、20小时以及诱导剂浓度达到1.00mM/L。在优化后BL21-pET15b-AKR7A3能够大量表达可溶性好、活性高、纯度达99.0%的醛酮还原酶AKR7A3。酶活性动力学检测结果表明，在37℃；PH=7；NADPH 浓度 0.2mmol/L；底物浓度2.00mmol/L；加酶量100μL；睾丸酮为底物时酶活力最高。

后续将在此基础上，将通过基因重组大量制备AKR7A3酶蛋白，进行酶激活剂及抑制剂的相关研究，从而筛选出对醛酮还原酶AKR7A3高效酶激活剂及抑制剂，为将来研究醛酮还原酶AKR7A3与相关癌症发生与发展的基础研究、以及及诊断与治疗药物研究提供实验基础。