益肺逐积方联合环磷酰胺对Lewis肺癌小鼠模型肿瘤体积及免疫功能的影响

张娜，刘学芳，蒋时红*，王琦，田燕歌

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国多数大城市肺癌的发病率和病死率一直居高不下［1］，90%以上肺癌患者发病年龄超过40岁，随着环境污染日益加重、人口老龄化加剧，肺癌造成的负担也日益加重［2］。在肺癌治疗上，早期以根治肿瘤为目标，以西医手术、放化疗为主，中医起辅助作用；中晚期肿瘤难以根除，以带瘤生存为主要目标，以中医辨证论治为主，配合西医靶向治疗、生物治疗、姑息治疗［3］。中医在很多方面显示出一定的疗效和优势，如增强机体免疫功能、减轻放化疗毒副作用、稳定瘤灶，延长患者带瘤生存时间、提高生活质量等［4］。

益肺逐积方是河南省中医研究院临床常用治疗肺癌的经验方，临床反复应用，在抑制瘤体质量、改善患者生存质量、与西药抗癌药物协同增效、减少放化疗毒副作用和延长生存期方面疗效显著。为了研究该方在治疗肺癌过程中的免疫调节作用，本课题组选用益肺逐积方联合环磷酰胺（CTX）对Lewis肺癌小鼠模型进行治疗，通过检测肿瘤体积、胸腺指数、淋巴细胞百分比等指标的变化，探讨益肺逐积方对CTX造成的免疫抑制是否具有改善效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与细胞株 2016年4—5月，选取SPF级C57BL/6雄性小鼠55只，5周龄，体质量（20±2）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2012-0001。细胞株：小鼠Lewis肺癌细胞株（LLC）由中国科学院生命科学研究院细胞库提供（上海）。

1.1.2 实验药物 益肺逐积方生药均购自河南中医药大学第三附属医院中药房，原方为露蜂房15 g，蛤蜊粉15 g，半枝莲30 g，生半夏10 g，三七粉10 g，西洋参10 g，百合15 g，川贝10 g，所购生药均由该院中药房鉴定并进行质量控制，由该院制剂科制成浓度为0.92 g/ml的中药液；CTX购于江苏盛迪医药有限公司，批号15101425。

1.1.3 实 验 试 剂 PE-anti-mCD4、FITC-anti-mCD8a和PerCP-Cy5.5-anti-mCD19单克隆抗体购于美国eBionscience公司，批号分别为E01012-1634、E00114-1636、E08313-1634。

1.1.4 实验仪器 JAZZ型流式细胞仪（美国BD公司），SW-VJ-2F型超净工作台（苏州苏洁净华有限公司），3111型CO2细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific公司），AL204型分析天平（METTLER TOLEDO公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 从液氮中取出冻存管，立即投入37 ℃水浴箱中水浴，摇晃至冻存液完全融化，复苏LLC，使用含100 ml/L FBS的DMEM培养基吹散转移至培养瓶中，在37 ℃CO2培养箱中培养，至对数生长期时2.5 g/L胰酶消化，制成2×104个/ml的细胞悬液，接种备用。

1.2.2 模型制备 选取5只小鼠，参考文献［5］在无菌条件下，将上述制备的细胞悬液，以每只0.2 ml接种于小鼠右前肢腋窝皮下，制备Lewis肺癌瘤源小鼠，第14天在无菌条件下，5只小鼠全部脱颈处死用于制备Lewis瘤细胞悬液。从腋下剥取瘤体组织，剪碎、匀浆、研磨，按肿瘤质量（g）与0.9%氯化钠溶液（ml）1∶3比例制成浓度为1×107个/ml的Lewis瘤细胞悬液。取Lewis瘤细胞悬液0.2 ml/只接种于C57BL/6实验小鼠右前肢腋窝皮下，共40只，用于制备Lewis肺癌小鼠模型。造模成功的标准是接种后7 d，接种部位可触及黄豆大小结节状肿块。

1.2.3 分组与给药 40只Lewis肺癌小鼠采用随机数字表法分为4组，即益肺逐积方组、CTX组、联合用药组、模型对照组，每组10只；余10只小鼠作为正常组。益肺逐积方组每日中药液灌胃14.95 g/kg（给药剂量参考临床用药量，按人与小鼠体表面积换算）［6］；CTX组在接种后72 h和10 d，腹腔注射CTX 40 mg/kg；联合用药组在CTX组用药基础上每日中药液灌胃14.95 g/kg；模型对照组和正常组每日灌胃与中药液等体积0.9%氯化钠溶液；各组均于造模第2天起开始用药，1次/d，连续14 d。

1.2.4 观察指标

1.2.4.1 肿瘤体积检测 给药14 d后，使用游标卡尺测量小鼠肿瘤长径（L）和短径（W），计算瘤体积（L×W2/2）［7］。

1.2.4.2 体质量、胸腺质量、胸腺指数检测 给药14 d后处死小鼠，称取体质量、胸腺质量，计算胸腺指数。胸腺指数（mg/g）=胸腺质量（mg）/小鼠体质量（g）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤体积比较 模型对照组、益肺逐积方组、CTX组、联合用药组小鼠肿瘤体积比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。益肺逐积方组、联合用药组小鼠肿瘤体积小于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；联合用药组小鼠肿瘤体积小于CTX组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 体质量、胸腺质量、胸腺指数比较 5组体质量、胸腺质量、胸腺指数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型对照组、益肺逐积方组、CTX组及联合用药组体质量小于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；益肺逐积方组胸腺质量及胸腺指数大于正常组及CTX组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

3 讨论

益肺逐积方由露蜂房、蛤蜊粉、半枝莲、生半夏、三七粉、西洋参、百合、川贝8味中药组成，药物组成合理，药味精简，君药为半枝莲与西洋参，既清热解毒又滋阴补气；生半夏、三七、川贝同为臣药，共奏除湿化痰、散瘀止血、消肿定痛之功；露蜂房为佐药，有通络之功；百合、蛤蜊同为使药，既清肺润燥止咳，又有利尿消肿、软坚散结之功。本方选药考究，辨证合理。

表1 4组小鼠肿瘤体积比较（±s，mm3）Table 1 Comparison of the tumor volume between 4 subgroups

表1 4组小鼠肿瘤体积比较（±s，mm3）Table 1 Comparison of the tumor volume between 4 subgroups

注：与模型对照组比较，aP＜0.05；与CTX组比较，bP＜0.05；CTX=环磷酰胺

组别 只数 肿瘤体积模型对照组 10 844.2±548.6益肺逐积方组 10 529.1±232.3a CTX组 10 590.8±184.2联合用药组 10 232.6±90.1ab F值 6.36 P值 ＜0.01

表2 各组小鼠体质量、胸腺质量及胸腺指数比较（±s）Table 2 Comparison of body weight，thymus weight and thymus indices between the normal control group，model control subgroup，YFZJD subgroup，CTX subgroup and YFZJD combined with CTX subgroup

表2 各组小鼠体质量、胸腺质量及胸腺指数比较（±s）Table 2 Comparison of body weight，thymus weight and thymus indices between the normal control group，model control subgroup，YFZJD subgroup，CTX subgroup and YFZJD combined with CTX subgroup

注：与正常组比较，aP＜0.05，与CTX组比较，bP＜0.05

胸腺指数（mg/g）正常组 8 23.6±1.1 38.8±7.3 1.6±0.3模型对照组 8 22.1±1.2a 44.5±6.1 2.0±0.3益肺逐积方组 8 21.5±1.5a 53.2±21.3ab 2.5±1.0ab CTX组 8 21.5±0.8a 34.3±6.3 1.6±0.3联合用药组 8 21.5±1.1a 44.6±9.1 2.1±0.4 F值 5.06 3.03 3.88 P 值 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05组别 只数 体质量（g）胸腺质量（mg）

表3 各组小鼠脾细胞中T、T、B淋巴细胞百分比比较（±s，%）Table 3 Comparison of the percentages of ，T-lymphocytes and B cells between the normal control group，model control subgroup，YFZJD subgroup，CTX subgroup and YFZJD combined with CTX subgroup

表3 各组小鼠脾细胞中T、T、B淋巴细胞百分比比较（±s，%）Table 3 Comparison of the percentages of ，T-lymphocytes and B cells between the normal control group，model control subgroup，YFZJD subgroup，CTX subgroup and YFZJD combined with CTX subgroup

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与CTX组比较，cP＜0.05

B淋巴细胞正常组 10 26.72±2.34 18.36±1.79 44.82±4.81模型对照组 10 18.51±2.98a 14.40±1.51a 51.26±4.24a益肺逐积方组 10 26.45±5.52b 20.05±2.68b 45.07±5.08bc CTX 组 10 24.13±4.13b 20.15±2.11b 25.12±2.6ab联合用药组 10 28.81±3.22bc 23.87±4.11abc 29.11±6.41ab F值 10.79 17.29 55.71 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01组别 只数 CD+4T淋巴细胞CD8+T淋巴细胞

CTX为一种烷化剂类化疗药物，具有抗癌谱广、疗效好的特点，已广泛应用于临床［8］，CTX可直接破坏肿瘤细胞DNA并阻止其复制，对白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等均具有一定的疗效［9］，同时CTX有较强的免疫抑制作用，常被用作免疫抑制药，如在骨髓移植时的免疫抑制治疗等［10］。CTX 20～50 mg/kg腹腔注射可以建立小鼠免疫抑制模型，在肿瘤学研究中，常用作肿瘤化疗免疫抑制动物模型。为了解决化疗药物的免疫抑制问题，降低化疗药物的毒性，本实验观察CTX与益肺逐积方联合用药对Lewis肺癌小鼠肿瘤体积以及免疫功能的影响。

实验结果显示，与模型对照组比较，益肺逐积方组及联合用药组均可显著减小肿瘤体积，其中以联合用药对肿瘤体积抑制效果最强，说明益肺逐积方对CTX抗肿瘤作用具有协同增效的效果。此外，益肺逐积方可使Lewis肺癌小鼠平均胸腺质量及胸腺指数显著增加，其联合CTX使用可明显减轻CTX对胸腺的抑制作用。流式细胞术检测结果显示，与模型对照组比较，益肺逐积方、CTX均可提高T、T淋巴细胞百分比，且联合用药作用最强。T淋巴细胞为初始T淋巴细胞，可分为Th1、Th2细胞，二者通过分泌不同的细胞因子如白介素（IL）-2，IL-4等，分别辅助细胞免疫和体液免疫，是扩大免疫应答的主要成分［11］；T淋巴细胞主要为杀伤性T淋巴细胞（CTL），CTL可直接杀伤带有致敏抗原肽-MHC分子的肿瘤细胞，通过与效靶细胞结合、释放穿孔素颗粒酶使肿瘤细胞裂解，最终使肿瘤细胞坏死、凋亡或溶解［12］。益肺逐积方可显著提高、T淋巴细胞百分比，在抗肿瘤免疫中具有正向的调节作用。B淋巴细胞是体液免疫应答的主要细胞，通过分泌抗体发挥抗肿瘤作用，如补体依赖性细胞毒活性，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，与肿瘤抗原结合阻断其生物学活性抑制肿瘤细胞增殖，消除其与血管内皮的黏附能力，防止肿瘤血道转移［13］。在Lewis肺癌使用CTX治疗的同时，可明显抑制小鼠脾B淋巴细胞百分比，益肺逐积方可显著改善CTX的免疫抑制作用。

综上所述，益肺逐积方联合CTX使用可显著抑制肿瘤体积，提高Lewis肺癌小鼠的胸腺指数，以及T、T、B淋巴细胞百分比，增强机体的抗肿瘤免疫功能，改善化疗药物的免疫抑制作用。本课题的研究结果为益肺逐积方在肺癌治疗中的应用提供了有力的实验依据。

本文局限性：

本文尚未对益肺逐积方抗肿瘤免疫相关因子进行深入研究，对淋巴细胞百分比的检测仅局限于脾脏，其在外周血、淋巴结的检测需在后续的研究中深入展开。

作者贡献：张娜进行文章的构思与设计，文章的可行性分析，负责文献/资料收集、整理，撰写论文；刘学芳、王琦进行论文的修订；田燕歌进行英文的修订；蒋时红负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。