月季F1代植株的组培快繁研究

武荣花，于晓淅，王 升，杨 攀，郭风民

(1.河南农业大学 林学院，河南 郑州 450002；2.郑州市城市园林科学研究所，河南 郑州 450051)

月季(RosahybridaL.)为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)观赏植物，具有花期长、花色鲜艳、品种丰富、株型多样的特点，是国内外重要的园林花卉，素有“花中皇后”的美称。在园林绿化中，月季被广泛栽植于庭院、广场、道路绿地等[1-4]。

植物组织培养是植物无性繁殖的一种重要手段。1967年，Hill[5]在研究建立月季品种再生体系的试验中，成功用茎段作为外植体诱导出愈伤组织，在月季组培方面获得重大突破。近年来，关于月季组织培养的研究陆续有报道。如钱蕾[6]研究发现丰花月季粉-A不定芽的最适诱导培养基为MS+2 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA，最适增殖培养基为MS+2 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA，最佳生根培养基为1/2 MS+(0.05～0.1)mg/L NAA；陈兰芬[7]对7个微型月季组织培养的研究发现，最适外植体材料是半木质化带芽茎段，最适增殖培养基为MS+0.5 mg/L BA+0.02 mg/L NAA+0.02 mg/L GA，生根培养基为1/2 MS+1.5 mg/L IBA。孟清秀等[8]通过对比试验，筛选出了藤本月季橘红火焰的适宜消毒方法及培养基配方。闫春霞[9]以藤本月季多特蒙德作为材料进行的组培试验发现，其适宜的诱导发芽培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA，增殖培养基为MS+1 mg/L KT+1 mg/L IBA，生根培养基为1/2 MS+ 0.5 mg/L IBA。但上述研究大多是以多年生月季材料为外植体，而对1年生月季组织培养研究的报道较少。鉴于此，本研究选择了3种月季杂交组合的5个1年生F1代植株，将其带芽茎段作为外植体进行组织培养，比较5个F1代植株在启动培养基上的萌芽率，筛选其适宜的增殖培养基、生根培养基，以期为今后的快繁试验和其他月季杂交后代的组织培养试验提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料的选择、处理

试验材料采集于郑州市城市园林科研所月季品种园，分别为阿托加×胭脂点玉的F1代AY02、AY03；胭脂点玉×魁松香的F1代YK01；春田×魁松香的F1代CK01、CK04。于2017年10月下旬，采集其健康的带芽茎段作为组培外植体。将采集回的枝条剪掉叶片，保留0.5 cm的叶柄，放在流水下冲洗，同时用小毛刷轻轻刷洗，去除表面灰尘。将冲洗干净的枝条浸泡在加入适量洗衣粉的水中15 min，并用磁力搅拌器不断搅拌。然后将枝条剪成2 cm的小段，每个茎段上带有1～2个饱满但未萌发的侧芽，剪好的茎段放在流水下冲洗1 h，用滤纸吸干表面水分，放置在超净工作台上备用。

1.2 试验方法

1.2.1 培养条件 本次试验中所有培养基均含有蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L，pH值调节至5.8。配制好的培养基以及试验所使用的镊子、小刀、培养皿、烧杯、无菌水等均使用高压灭菌锅在120 ℃条件下灭菌20 min。培养室光照强度为2 000 lx，光照时间为10～12 h/d，温度为(24 ± 1)℃。

1.2.2 启动培养 启动培养接种前进行外植体消毒，对外植体消毒条件进行了预试验，最终确定为：先将外植体浸润在75%酒精中30 s，倒出酒精后再用2%的NaClO溶液消毒13～14 min，之后用无菌水冲洗5次。消毒过程中不断搅拌。启动培养的基本培养基为MS培养基，再添加2 mg/L的6-BA、0.1 mg/L的NAA作为外源激素。每个材料20瓶，每瓶接种2株消毒过的外植体。接种后第3天开始，每隔1 d统计1次褐化情况及污染率。腋芽生长至1.5 cm时进行增殖培养。增殖培养期间统计外植体的萌芽率。萌芽率=(萌发外植体数/接种外植体数)×100%，统计时假设污染为零。

1.2.3 增殖培养 将在启动培养基上萌发的适宜大小的腋芽从基部切掉，与外植体分离，去掉老化的组织后即可接种到增殖培养基上。增殖培养使用的基本培养基为MS培养基，添加不同质量浓度的外源激素6-BA、NAA。其中6-BA的质量浓度有2个水平，分别为1 mg/L、2 mg/L；NAA的质量浓度有3个水平，分别为0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L，具体见表1。接种30 d后统计各品种的增殖系数(继代次数为1)。增殖系数=(培养后总芽数/接种时总芽数)×100%，统计时假设污染为零。

表1 增殖培养基外源激素质量浓度

1.2.4 生根培养 增殖培养中生长强健、长度超过2 cm的丛生芽可以进行生根培养。将丛生芽切分成单株的芽，接种到生根培养基上。生根培养基使用的基本培养基为1/2 MS培养基，使用的外源激素为NAA，设置4个质量浓度水平，分别为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L。接种15 d后，每隔3 d观察1次，统计组培苗的生根数量及生根率。生根率=(生根幼苗数/接种幼苗总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 不同材料外植体启动培养萌芽率

将消毒后的外植体接种到启动培养基MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，约1周后腋芽开始萌动，发芽率见表2。可以看出，AY02的萌芽率最低，只有64.00%，其余4个F1代茎段外植体的萌芽率均达到了70%以上，其中YK01的萌芽率最高，为83.33%。

表2 不同材料外植体启动培养萌芽率 %

2.2 不同材料腋芽增殖培养的增殖系数

从表3可以看出，不同材料腋芽在不同增殖培养基上的增殖系数差异较为明显。总体来看，6-BA质量浓度为2 mg/L时，不同材料腋芽的增殖系数均高于6-BA质量浓度为1 mg/L时的增殖系数。其中，AY02、CK01的整体增殖系数在6个处理中整体较高，而AY03的整体增殖系数在6种增殖培养基中均偏低。AY02在增殖培养基6中增殖系数最高；AY03、YK01、CK01在增殖培养基5中增殖系数最高；CK04在增殖培养基5和增殖培养基6中增殖系数相同，均为最高。

由此可知，本次试验中AY02的最适增殖培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，AY03、YK01、CK01的最适增殖培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，CK04的最适增殖培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA和MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

表3 不同材料腋芽增殖培养的增殖系数 %

注：同行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.3 不同材料组培幼苗在生根培养基上的生根情况

由表4—5可知，AY02在NAA质量浓度为0.1 mg/L时生根率最高，其他4个材料组培幼苗在NAA质量浓度为0.2 mg/L时生根率最高；当NAA质量浓度超过0.2 mg/L时，5个材料组培幼苗的生根率均逐渐下降，平均生根数也逐渐降低。因此，在本次生根培养设置的NAA质量浓度梯度中，AY02的最适生根培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA，AY03、YK01、CK01、CK04的最适生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA。

3 结论与讨论

试验以较常用的带芽茎段作为外植体，萌发较快且长势较好。

表4 不同质量浓度NAA对不同材料组培幼苗

表5 不同质量浓度NAA对不同材料组培苗

在预试验中发现，当用2% NaClO溶液灭菌10 min时，外植体的污染率偏高，接近50%。增加消毒时间至13 min时消毒效果较好，污染率在33%左右。而消毒时间大于14 min时，部分外植体会有褐化、死亡的情况，故外植体的消毒时间宜在13～14 min。F1代植株均为1年生苗，植株较低矮，离地面较近，枝条上灰尘较多，这可能是其表面微生物较多，造成组培污染率偏高的主要原因。

外植体在启动培养时均能正常萌芽。而此次试验由于外植体材料较少，启动培养并未设置激素质量浓度梯度，5个月季F1代植株外植体的萌芽率均未超过90%，试验设置的启动培养基可能并非最佳条件。在后续的组培快繁试验中应设置不同质量浓度的激素启动培养基，以找到月季F1代植株外植体萌芽效果最好的启动培养基。

与多年生的月季植株相比，本次试验作为外植体的月季F1代植株生长时间较短，植株较为幼嫩。故在本次增殖培养试验中，参考沈国正等[10]、邱文青等[11]的增殖培养基中的激素含量，培养基中设置的NAA质量浓度较低。增殖培养基中的6-BA质量浓度在2 mg/L时总体增殖系数较高。AY02的最适增殖培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；AY03、YK01、CK01的最适增殖培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；CK04的最适增殖培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA和MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。在增殖培养中发现，增殖出的月季F1代组培苗与相同培养基上的多年生月季组培苗相比长势偏弱，同样可能和月季杂交1年生幼苗植株生长时间不长、营养物质积累较少有关。

生根培养是组织培养的重要一步，只有能正常生根的幼苗才能最终形成完整的植株。AY02的最适生根培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA；AY03、YK01、CK01、CK04的最适生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA。本次生根培养中，当NAA质量浓度在0.1 mg/L或0.2 mg/L时，月季F1代的生根效果较好。而NAA质量浓度>0.3 mg/L时，生根效果反而不好。可以看出，较低质量浓度的NAA对月季生根有促进作用，而NAA质量浓度过高时反而会对月季生根产生抑制作用。