利用SSR技术鉴定西瓜品种纯度

孙波 邹甜 王志伟 吴琪 杨红波 王兴辉 孙小武

摘 要： 利用SSR分子标记技术对‘雪龙三号西瓜品种及其亲本间的多态性进行了引物筛选和种子纯度研究。结果表明，在供选的23对SSR核心引物中，有2对引物（BVWS02048和BVWS00106）在‘雪龙三号杂交种及其亲本的带型具有多态性。利用这2对引物对‘雪龙三号进行純度鉴定，鉴定结果均为98%，与大田纯度检测结果吻合率达99%，说明SSR分子标记对‘雪龙三号的纯度鉴定结果是可靠的。同时2对引物鉴定结果的一致也验证了品种的真实性。

关键词： 西瓜； DNA提取； SSR标记； 纯度鉴定

Abstract： In the study， SSR markers were used to screen polymorphic primers between ‘Xuelong No. 3 watermelon cultivar and their parents， and to identify seed purity of ‘Xuelong No. 3. Results showed that the two （BVWS02048 and BVWS00106） of 23 core SSR primers has be more polymorphic at ‘Xuelong No. 3 hybrids and their parents. Subsequently， the two pairs of primers were used to determine the purity of ‘Xuelong No. 3， and their purification results were 98%， which was up to 99% prediction matches morphological analysis. These results indicated that a purity identification of ‘Xuelong No. 3 using SSR molecular markers is viable. Simultaneously， the uniform results of these two pairs of primers also verified the authenticity of cultivar.

Key words： Watermelon；DNA extraction；SSR markers；Identification of purity

据统计，2016年我国西瓜播种面积189.08万hm2，总产量7 940万t[1]，在部分地区西瓜产业已成为主导产业。生产上因“假种子”造成损失的现象层出不穷，品种的纯度与种子质量密切相关。由于传统的纯度鉴定多以形态标记为主，其检测周期长且结果易受环境影响。分子标记鉴定可以大幅提升检测效率，而且鉴定过程由于减少了外界因素干扰，其结果也更加准确。

利用分子标记技术鉴定西瓜品种纯度的技术已较为成熟。赵胜杰等[2]利用SRAP技术对生产上主推的9个无籽西瓜品种进行了杂交种纯度鉴定；王鸣刚等[3]认为只要反应条件适合、引物选择正确，RAPD技术完全适用于西瓜杂交种的纯度鉴定；而闫鹏等[4]通过对100条RAPD引物的筛选，未能筛到在Tx14E及其亲本间具有多态性的RAPD标记；李菊芬等[5]比较了RAPD、ISSR、SSR 3种方法在西瓜杂交种及其亲本间的多态性，仅在供试的SSR引物里找到了特异引物，这说明SSR分子标记技术相对于其他分子标记技术具有一定的优越性，在其他农作物如水稻[6]、小麦[7]、玉米[8]、油菜[9]纯度鉴定中均有广泛应用。李超汗等[10]从28对SSR核心引物里筛出了5对特异引物，可对5个西瓜品种进行纯度鉴定。随着西瓜全基因组的测序完成，随之开发出的SSR核心引物极大地加快了该技术在西瓜种子纯度鉴定方面的进程。

‘雪龙三号西瓜品种是湖南地区主栽品种，耐重茬，高抗枯萎病，笔者旨在通过对23对SSR核心引物的筛选，对该品种的纯度进行快速、准确的鉴定，以缩短检测周期、保障瓜农利益。同时为核心SSR标记在西瓜纯度鉴定方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

‘雪龙三号及其亲本由湖南省瓜类研究所提供。以‘雪龙三号及其亲本为材料进行引物筛选。DNA提取试剂盒及PCR扩增试剂均购于天根生物公司，引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 引物筛选阶段DNA提取方法 取‘雪龙三号种子10粒，亲本种子各5粒，将种子用55 ℃热水浸种3 h，放入恒温培养箱32 ℃催芽，待种芽长到约3 cm长的时候，取下种芽混合放入圆底EP管，加入石英砂用玻棒用力研磨至种芽在管内呈乳白色粉末状，然后按照DNA提取试剂盒进行操作。

1.2.2 纯度鉴定阶段DNA提取方法 取100粒‘雪龙三号种子放入圆底EP管，加入石英砂，利用高通量自动研磨器进行研磨，研磨充分后（每次研磨时间3 min，研磨2～3次）按照DNA提取试剂盒进行操作。

1.2.3 DNA质量及浓度检测 通过微量核酸蛋白分析仪测定。

1.2.4 SSR-PCR反应体系及扩增程序 引物来源：参照国家蔬菜工程中心许勇团队发表的23对西瓜SSR核心引物，核心引物位点覆盖全基因组且均匀分布于西瓜的染色体上[11]（表1）。反应总体系为20 μL，其中Taq Buffer 2 μL（Mg2+为15 mmol·L-1），2.5 mmol·L-1的dNTPS加1.6 μL，Taq酶为1 U，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，DNA为50 ng。扩增程序为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性20 s，55 ℃复性20 s，72 ℃延伸90 s，35次循环，72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR产物在3%琼脂糖凝胶上进行电泳（电泳缓冲液为0.5×TBE），电泳完毕在凝胶成像仪上观察。

1.2.5 特异引物条件的优化 对扩增效果不理想的特异引物，通过扩大凝胶浓度，减小电泳时的电压以及延长电泳时间来进行优化。

1.2.6 SSR分子标记的纯度鉴定结果与大田纯度鉴定结果的比较 田间纯度结果由科研人员于2017年9—11月在海南省乐东县利国镇红五村种植，通过观察株形、坐瓜节位、果型等形态指标检测得到。在邵陽市农业科学研究院生物技术中心利用SSR特异引物对同一批次的种子进行纯度鉴定。室内检测纯度结果与大田检测纯度结果吻合率=室内结果/田间结果。

2 结果与分析

2.1 SSR特异引物的筛选

利用23对引物在‘雪龙三号及其亲本间进行扩增，有2对引物在亲本及F1之间具有多态性（图1），分别为BVWS02048和BVWS00106。其中BVWS02048可以看出F1和亲本有差异，但特异条带不明显。BVWS00106在F1扩出的条带一条来自父本，一条来自母本，为典型的双亲互补型条带，且条带较为清晰无杂带，特异位点位于5号染色体上，可用于‘雪龙三号的纯度鉴定。

2.2 特异引物条件的优化

BVWS02048由于特征带未完全分开，采用扩大凝胶浓度，降低电压，延长电泳时间的方法来进行电泳。将琼脂糖凝胶的浓度增加到4%，电泳时电压由100 V降低到70 V，电泳时间延长至120 min。电泳结果如图2，可以看出，F1的特征带较为明显，特异位点在10号染色体上。一般品种不纯主要由母本自交引起，因此只要引物扩出的条带在母本与F1之间有差异就可以用来做纯度鉴定，所以BVWS02048也可用来检测‘雪龙三号的纯度。

2.3 ‘雪龙三号纯度的鉴定

2.3.1 田间纯度鉴定 科研人员播种150粒，成苗145棵，在果实成熟期通过观察株型、坐瓜节位、果型等形态指标，判断有2株为母本自交株，纯度为98.6%。

2.3.2 SSR分子标记纯度鉴定 取与田间纯度鉴定同一批次的‘雪龙三号种子200粒，平均分成2份，分别用BVWS02048、BVWS00106来进行纯度鉴定。利用BVWS02048对‘雪龙三号进行纯度鉴定的部分电泳图如图3，有2粒种子扩出的条带与F1有差异，由于BVWS02048扩出的父本和母本条带之间差异较小，因此无法确定2粒假种子是父本混杂还是母本混杂，一般而言，除开机械混杂的可能性，母本混杂是品种不纯的主要原因，即BVWS02048进行纯度鉴定的结果为98%。利用BVWS00106进行纯度鉴定的部分电泳图如图4，可以看出有2粒种子扩出的条带与母本相同，为母本自交株，BVWS00106纯度鉴定结果也为98%。2对特异引物鉴定结果与大田鉴定结果吻合率98%/98.6%≈99%，且2对引物鉴定结果的一致也说明了品种的真实性。

3 讨论与结论

在种子生产过程中，种子不纯主要是因为母本去雄不彻底自交而产生的假杂种，所以一般纯度鉴定只需要找到在母本与F1代有多态性的引物即可。但由于外源花粉的飞入或者人工造成的不同品种间的机械混杂，则需要利用多对特异引物的组合来进行鉴定，即构建多重PCR体系，以保证品种真实性，提高准确率。目前利用多重PCR对品种进行鉴定在其他作物上已有应用，常宏等[12]通过对玉米SSR核心引物进行重新分析与设计，建立了21对SSR通用引物构成的8组多重PCR体系，大大提高了检测效率，为多重PCR技术在玉米上的应用奠定了坚实的基础。陈浩东等[13]利用了最多四重SSR-PCR对棉花品种进行了纯度鉴定，并且对多重PCR的程序进行了优化。多重PCR在西瓜品种鉴定方面的应用鲜有报道，仅刘子记等[14]曾建立了双重PCR体系鉴定了小西瓜‘美月的纯度。笔者则是通过对2对特异引物鉴定结果的比较来保证品种的真实性，并未将特异引物进行组合。在西瓜品种纯度的研究里，大多数研究人员确定品种真实性的方法与笔者类似，但此方法略显繁琐，随着SSR核心引物的开发，对核心引物进行组合，尽快的建立SSR核心引物的多重PCR，将会极大地促进西瓜品种纯度研究的发展。

笔者通过对23对SSR核心引物的筛选，2对引物在‘雪龙三号及其亲本间具有多态性，在琼脂糖凝胶电泳中，扩大凝胶浓度，降低电压，延长电泳时间可以更好区分开长度相差较小的条带。利用特异引物对‘雪龙三号进行纯度鉴定的结果与大田鉴定结果吻合率达99%，充分说明SSR分子标记技术鉴定品种纯度是可靠的。同时利用多对特异引物对品种进行纯度检测，既可以验证品种的真实性，还能准确反映纯度检测结果。

参考文献

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