猪圆环病毒2型Rep蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

高 梅，彭 喆，吴晓燕，时建立,，辛长勋，郑书轩，刘玉伟，王 硕，王金宝,*，李 俊,*

(1.山东师范大学 生命科学院，山东 济南 250014；2.山东省农业科学院 畜牧兽医研究所，山东 济南 250100；3.青岛农业大学 动物医学院，山东 青岛 266109)

猪圆环病毒2型(PCV2)是危害养猪业的一种重要致病性病原，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合症，其临床主要表现为仔猪断奶后生长迟缓、体重减轻、皮肤苍白、呼吸衰竭、呼吸痛苦、被毛蓬乱等，该病不但可以引起断奶仔猪淋巴衰竭、腹泻、淋巴组织肉芽肿性炎症、死亡，还能引起仔猪先天性脑震颤、母猪繁殖障碍等，并可能与猪皮炎肾炎综合征、呼吸道疾病综合征等疾病密切相关[1-4]。更为严重的是，感染PCV2所引起的猪免疫抑制会导致猪其它疾病免疫的失败，并引起其它病原的继发性感染，给养猪业造成难以估量的经济损失。

猪圆环病毒2型属于圆环病毒科圆环病毒属，为迄今已知最小的动物病毒之一，直径17 nm，无囊膜，基因全长为1 767 bp或1 768 bp，共有11个开放阅读框，其中以ORF1和ORF2最为重要。ORF1阅读框编码与病毒复制相关的Rep蛋白，编码314个氨基酸，该蛋白氨基酸序列相对保守，Rep mRNA是病毒基因组的初始转录物，与病毒的复制密切相关；ORF2编码233个氨基酸，为病毒衣壳的结构蛋白，即衣壳(Cap)，也是主要的免疫原性蛋白[5-8]。目前，基于Cap蛋白，国内外学者已经建立了一系列的研究及检测方法，而对Rep蛋白的研究报道较少，本研究以本实验室克隆构建的重组质粒PQE30-PCV2 Rep进行融合蛋白表达，纯化后的蛋白作为免疫原免疫小鼠，利用细胞杂交瘤筛选技术制备了针对PCV2 Rep蛋白的特异性单克隆抗体，为PCV2的进一步研究和诊断奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和动物 PQE30-PCV2 Rep原核表达载体、大肠杆菌M15，由山东省畜禽疾病防治与繁育重点实验室保存；SPF级BALB/c小鼠，雌性，8～10周龄，购自山东大学试验动物中心。

1.1.2 试剂耗材 IPTG、Acr、Bis、Tris、PEG、SDS、TEMED，Sigma公司；Protein Marker，Thermo公司；Yeast Extract，oxoid公司；0.22 μm无菌滤器，Millipore公司；DMEM培养基，Gibco公司；Ni2+IDA亲和层析胶，Novagen公司；小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒 Proteintech，武汉三鹰生物技术有限公司。其它试剂为国产分析纯。

1.1.3 试验仪器 HC-3018R高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；ZHWY-100B恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；3111-水套式CO2培养箱，Thermo scientific公司；蛋白电泳仪，BIORAD公司； Gel Doc XR+ 凝胶成像系统，BIORAD公司；Spectra Max I3多功能酶标仪，美国MD公司；AUW120D电子天平，日本岛津有限公司；NanoDrop 2000，Thermo公司。

1.2 方 法

1.2.1 IPTG诱导PQE30-PCV2 Rep融合蛋白的表达与纯化 将测序正确的原核表达重组质粒PQE30-PCV2 Rep转化M15感受态细胞[9-10]，挑取转化平板上的单菌落接种于卡那霉素浓度为50 μg/L的LB液体培养基，37 ℃ 200 r/min培养过夜，次日按1:100接种于氨苄青霉素浓度为50 μg/mL的LB培养液中，37 ℃ 200 r/min振摇至菌体OD600为0.8～1.0；取出1mL培养物，10 000 g室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，振荡培养过夜，诱导融合蛋白表达；取出1 mL培养物，10 000 g室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物离心后弃上清，PBS重悬菌体沉淀进行超声波破碎，分别取上清液与沉淀液进行12%SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色显带。

1.2.2 包涵体蛋白的变复性与纯化 将菌体沉淀重悬于Lysis buffer超声破碎，破碎后的细胞裂解液4 ℃离心收集沉淀；对包涵体进行洗涤液洗涤3次、变性剂溶解、透析袋透析复性过夜。最后Ni柱亲和纯化，进行12% SDS-PAGE分析。

1.2.3 单克隆抗体的制备

1.2.3.1 小鼠免疫 选取5只雌性BALB/c小鼠，将PQE30-PCV2 Rep蛋白与弗氏佐剂混合免疫，皮下注射100 μg/只，2周加强免疫一次，共免疫4次，采血进行间接ELISA检测，以确定抗血清针对PQE30-PCV2 Rep蛋白的效价，待效价>1:10000时进行细胞融合。

1.2.3.2 细胞融合 四次免疫后血清ELISA效价在1:10000以上的小鼠，在融合前3 d终免，腹腔注射抗原100 μg。融合当天无菌取脾脏研磨，收集脾细胞，按骨髓瘤细胞:脾细胞=1:20比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞。将混合后细胞用DMEM培养基稀释后1 000 r/min 5 min离心后弃上清，缓慢加入50%聚乙二醇，反应90 S后再加入DMEM培养基终止反应，融合的细胞置37 ℃水浴锅中反应10 min。1 000 r/min 5 min离心弃上清，加入HAT DMEM培养基混悬，混悬后的细胞按100 mL/孔加到96孔板中，将细胞培养板置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。融合约10 d后开始进行筛选检测[11-13]。

1.2.3.3 融合检测及亚克隆 检测的前一天，用PBS包被5 μg/mL抗原于ELISA板过夜。检测时吸取细胞上清进行ELISA检测，100 μL/孔。根据ELISA结果，样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1判定为阳性孔。将检测出的阳性孔进行第二次ELISA检测重复确认，确认后的阳性孔细胞进行亚克隆，至检测100%阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。

1.2.4 单克隆抗体小鼠腹水制备及抗体亚型鉴定BALB/c小鼠腹腔中注射矿物油，0.5 mL/只，7 d后腹腔注射用阳性克隆杂交瘤细胞(1×106细胞/只)，诱导产生腹水。注射免疫8～12 d后，收集腹水，按小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书进行鉴定，用间接ELISA方法对1G4，2G4，6H12细胞株诱生的小鼠腹水单抗进行分析。

1.2.5 小鼠腹水单克隆抗体效价、纯度测定 取6H12腹水进行Protein A纯化，得到所需纯化抗体后立即置PBS中4 ℃透析过夜，次日进行浓度、纯度、效价等检测。采用间接ELISA法测量小鼠腹水的抗体效价，用PBS包被液将PQE30-PCV2 Rep蛋白按5 μg/mL浓度加入板条中置4 ℃冰箱过夜，100 μL/孔。次日弃去包被液，洗板2～3次，按200 μL/孔加入封闭液，置37℃恒温箱1 h后弃去内液，洗板1次。纯化抗体按起始稀释度为1∶500，100 μL/孔37 ℃恒温箱放置1 h进行一抗反应。一抗反应结束后，将酶标板中内液弃去，洗涤3次，每孔中再加入100 μL 1/5 000山羊抗小鼠-HRP酶标二抗，37 ℃恒温箱反应1 h。二抗反应结束后取出酶标板，洗涤4次，加入TMB显色液，100 μL /孔，37 ℃ 15 min显色，再每孔加入100 mL1 mol/L HCL溶液，终止反应。于酶标仪450 nm波长处测定吸光度，将样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，进行纯度检测。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白的诱导表达纯化分析

重组质粒转化M15后IPTG诱导表达，收集处理样品，经12% SDS-PAGE检测，发现IPTG诱导后的样品在分子量40 kDa附近出现明显条带，其大小与预期表达产物分子量相符，而未经IPTG诱导的样品则无明显条带(图1)，证明重组质粒PQE30-PCV2 Rep在大肠杆菌M15中成功表达。

对菌体裂解液的上清和沉淀进行12% SDS-PAGE检测，结果显示PQE30-PCV2 Rep蛋白出现在沉淀中，主要以包涵体的形式表达，故对目的蛋白进行复性纯化，以获得目标蛋白。12% SDS-PAGE检测结果显示在约分子量40kDa处有明显条带(图2)，表明重组PQE30-PCV2 Rep蛋白纯化成功。

2.2 4免后小鼠血清效价ELISA结果

4次免疫后，取小鼠血清用间接ELISA 方法进行抗体效价测定，结果显示，2#、3# 小鼠的血清抗体效价较高，其中以2#小鼠效价最高，满足细胞融合的要求。

图1 PQE30-PCV2 Rep表达图 M.蛋白Marker;1.诱导前；2.诱导后；3.超声破碎后上清；4.超声破碎后沉淀Fig.1 Expression diagram of PQE30-PCV2 Rep M.Protein marker;1.before induction; 2.after induction;3.induced supematant after sonication; 4.induced prcipitate after sonication

图2 PQE30-PCV2 Rep纯化图 M.蛋白Marker;1.样品；2.经柱流出3.洗脱Fig.2 Purification diagram of PQE30-PCV2 Rep M.Protein marker;1.sample; 2.out of the column;3.elution

序号Number稀释度DilutionOD值 OD value(A450 nm)1#鼠 1# mice2#鼠 1# mice3#鼠 1# mice4#鼠 1# mice5#鼠 1# mice15002.9753.1353.0073.0412.83921,5002.8853.1863.0072.8902.77534,5002.3572.9132.7982.3572.370413,5001.3622.2242.0831.5151.460540,5000.7021.1981.1420.7810.7076121,5000.6031.0881.0430.6050.5627Blank0.062

2.3 单克隆抗体制备与生物学特性

2.3.1 阳性杂交瘤细胞株的筛选 选取效价较高的2#小鼠进行细胞融合，融合后第7天观察融合率为80%以上。ELISA检测进行筛选获得3株杂交瘤细胞，分别命名为1G4，2G4，6H12，挑取单克隆进行培养，置液氮冻存。经复苏后测定细胞仍保持分泌抗PQE30-PCV2 Rep蛋白的能力，扩大培养后腹腔接种于BALB/c小鼠，接种后约10 d小鼠产生腹水并收集。

2.3.2 单克隆抗体的亚类鉴定 用间接ELISA方法对1G4，2G4，6H12细胞株诱导产生的小鼠腹水单抗进行分析，结果表明腹水1G4属于IgG2a型；腹水2G4和6H12属于IgG2b型。选取OD值最高的细胞株6H12进行深入研究。

2.3.3 小鼠腹水单克隆抗体效价测定 通过抗体ELISA效价结果得出，6H12抗体ELISA效价在256K左右。

表2 定株后细胞上清ELISA结果Table 2 ELISA results of cell supernatant

表3 6H12抗体间接ELISA 结果Table 3 Indirect ELISA results of 6H12 antibody

2.3.4 抗体浓度测定 纯化后6H12抗体用紫外分光光度计检测，抗体浓度为0.47 mg/mL。

2.3.5 抗体纯度鉴定 纯化后6H12抗体进行12% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果显示抗体纯化后纯度在90%以上。

图3 6H12抗体纯度鉴定图Fig.3 Purity idenfificafion diagram of 6H12 antibody

3 讨 论

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，根据抗原性和致病性的不同，分为圆环病毒1型(PCV1) 和圆环病毒2型(PCV2)，圆环病毒1型对猪没有致病性，圆环病毒2型对猪有致病性，是猪断奶后多系统衰竭综合症(PMWS)等疾病的病原。PCV2不仅可以引起猪断奶后多系统衰竭综合症，而且与猪皮炎与肾病综合征、母猪繁殖障碍、坏死性肺炎、肠炎、猪繁殖与呼吸障碍综合征等疾病亦有重要关联[14-16]。由阅读框ORF2编码的Cap蛋白是重要的结构蛋白，与病毒和宿主细胞结合及与机体的免疫应答保护反应密切相关，在PCV1和PCV2之间较大，因此对PCV2的Cap蛋白编码基因的研究是当前热点，国内外学者业已建立了一系列基于Cap蛋白的研究及检测方法[17-19]，而相对Rep蛋白的研究则较少[20-22]。

本研究采用原核表达系统对Rep蛋白进行表达，用纯化后的蛋白作为抗原免疫小鼠后细胞进行融合，常规杂交瘤细胞筛选技术制备杂交瘤细胞系，采用间接ELISA筛选获得3株特异性分泌抗ORF1蛋白的杂交瘤细胞系，并进行了连续传代培养和冻存，用间接ELISA方法对1G4，2G4，6H12细胞株诱导的小鼠腹水单抗进行分析，亚型鉴定结果表明,腹水1G4属于IgG2a型；腹水2G4和6H12属于IgG2b型。然后我们选取了6H12株单克隆抗体进行后续研究，结果显示6H12单抗效价在256K左右，浓度为0.47 mg/mL，抗体纯化后纯度在90%以上。本试验采用常规免疫的方法免疫制备单抗，取得了较好的免疫效果，试验从杂交瘤细胞经过连续传代培养、液氮冻存经复苏后分泌抗体的能力、以及单克隆抗体的亚类、浓度、纯度、效价等多方面，考察了3株杂交瘤细胞分泌抗体的能力和所制备的单克隆抗体的特性。因此，本研究成功制备了3种单克隆抗体，在后续工作中，可继续研究这3种单抗用于Rep蛋白的定量检测、胶体金试纸条的制备、ELISA诊断试剂盒的研发等，同时也为猪圆环病毒2型的检测、诊断与预防提供了新方法。