精胺对心肌梗死的保护作用及机制的实验研究

张聪聪 程乃萱 陈博雅 李玉琳 杜 杰

急性心肌梗死是一种高发病率和高致死性疾病。冠状动脉血管闭塞后，心肌细胞缺血缺氧导致大量的死亡，进而发生心室结构和功能的改变，最终导致心力衰竭[1]。因此有效的预防心肌细胞死亡可以提高心肌梗死的预后。精胺(spermine, SP)是细胞中普遍存在的一类脂肪胺类小分子化合物，也可从食物中摄取，主要参与多胺代谢。近年来研究显示,SP可以参与细胞的自噬、凋亡、增殖等多种生物学过程[2-3]，但其是否影响心肌梗死后的心脏重构过程尚不清楚。本研究以小鼠冠状动脉前降支结扎的方法构建小鼠急性心肌梗死模型[4]，并给予SP喂水处理后观察SP对小鼠心肌梗死后心功能和心脏重构的影响并探讨其可能的作用机制。

材料与方法

1. 实验动物 SPF级,C57BL/6J小鼠,40只，雄性，10周龄，体质量20～23g，由首都医科大学附属北京安贞医院实验动物房提供。购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号:SCXK(京)2014-0004，使用许可证号: SCXK(京)2015-0023。小鼠随机分为三组: 对照组(10只)，模型组(15只)和SP处理组(15只)。

2. 主要试剂 精胺(Sigma，美国)，反转录试剂盒(Promega，美国)，realtime-PCR试剂盒(TaKaRa，日本)，氯化三苯四唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色剂(Sigma，美国)，天狼猩红染色液(中杉金桥，中国)，小鼠IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA检测试剂盒(R&D，美国)。

3. 冠状动脉前降支结扎诱导小鼠心肌梗死模型制备 小鼠异氟烷麻醉后仰卧固定在鼠板上，在小鼠心脏部位第三四肋间隙位置做一约1.5cm纵向切口，用3-0 丝线打一荷包松结备用，钝性分离胸大肌肉与肋骨外肌肉; 于第三四肋间穿破胸膜和心包膜，左手迅速将心脏挤出，在小鼠左心耳下缘下2mm处以6-0丝线结扎冠状动脉，可见左心室前壁颜色由鲜红变为暗紫至苍白色; 快速将心脏推入胸腔，挤出胸内气体，打紧荷包关胸，摘除麻醉面罩，等待小鼠自然苏醒。假手术组手术时丝线仅穿过左冠状动脉主干而不结扎冠状动脉。所有小鼠均普通饮食饲养，自由进食、进水。

4. 小鼠心功能测定 于MI术后7d通过小动物超声进行小鼠心功能测定，主要检测指标如下：室间隔厚度(interventricular septum，IVS)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPW)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension, LVEDS)、左心室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume, LVESV)、左心室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume, LVEDV)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室缩短分数(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

5. 心脏组织病理切片的制备 术后28天收取小鼠心脏组织，使用10%中性甲醛固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。天狼星红染色：切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水，天狼星红染色液室温染色30min，自来水洗去浮色，无水乙醇5mL, 2次，二甲苯透明，中性树胶封片。WGA染色：切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水，柠檬酸缓冲液(pH=6.0)抗原修复90s，1 x PBS缓冲液洗3遍，羊血清封闭液室温封闭30min，WGA工作液(10μg/mL, Sigma,美国)37℃,孵育60min，1× PBS缓冲液洗3遍，DAPI封片。使用电子荧光显微镜(Nikon，日本)进行病理图像采集，使用NIS Br 3.0软件进行图像分析。

6. realtime-PCR检测小鼠心脏组织凋亡相关基因和炎症相关基因的mRNA水平 取相同质量50 mg 的心脏组织放入匀浆器内，加入1 mL Trizol(Invitrogen，美国)提取RNA，用Nanodrop 2000(Thermo，美国)测定RNA 的浓度和OD260 /280 比值。各样本均按5μg RNA 相对应的体积(n μL) 根据反转录试剂盒说明书进行反转录，转录体系为20 μL 体系，将混合好的液体放置在PCR仪中，反应条件为42℃, 60min;95℃ 5min。将反转好的cDNA按照realtime-PCR试剂盒说明书进行PCR，使用Bio-RAD CFX ConnectPCR仪进行反应，反应条件为95℃, 2min→95℃, 15s;60℃, 30s(40个循环)→60℃, 5s，每个循环增加0.5℃～95℃。以GAPDH作为内参。基因的表达水平以得到的相应的Ct 值用2 (CtGAPDH-Ct目标基因) 法进行计算。引物序列分别为: Bcl2∶5’-AACATCGCCCTGTGGATGAC-3’(上游)，5’- AAACAGAGGTCGCATGCTGG -3’(下游)；Bcl-xL：5’-AGTAAACTGG GGTCGCATCG-3’(上游)，5’- GCCATCCAACTTGCAATCCG -3’(下游)；IL-6∶5’-GGTGACAACCACGGCCTTCCC-3’(上游)，5’- AAGCCTCCGACTT GTGAAGT GGT -3’(下游)；TNF-α：5’- TAGCCCACGTCGTAGCAAAC -3’(上游)，5’- ACAAGGTACAACCCATCGGC -3’(下游)；IL-1β：5’-CGTGGACCTTCCAG GATGAG-3’(上游)，5’-CATCTCGGAGCCTGTAGTGC -3’(下游)；GAPDH：5’- CATGGCCTTCCGTGTTCCTA -3’(上游)，5’-GCGGCACGTCAGATCCA -3’(下游)。

7. 心脏组织TTC染色检测心肌细胞活力 于术后1d各组小鼠摘取心脏，迅速放在负20℃冻存15分钟，自心尖至心底垂直与心脏长轴横切成约1mm厚组织切片，将切片置于1% TTC溶液中,37℃,温孵15 min，心脏整体及染色后组织切片进行拍照，分析死亡心肌(白色)占左心室面积比例。

8. 血清炎症因子TNF-α、IL-6 和IL-1β的检测 在收取小鼠血液待其凝固后，3 000转/min离心10分钟，吸取上层血清冻于-80℃待检测。分别使用TNF-α、IL-6 和IL-1β的ELISA试剂盒检测血清中炎症因子的水平，步骤参照说明书进行，使用酶标仪(Biotek，美国)进行数据的读取和分析。

9.统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计学分析。首先进行正态分布检验，符合正态分布计量数据以均数±标准差表示，两组之间的比较采用非配对t检验，多组之间的比较采用One-way ANOVA。不符合正态分布的数据两组之间比较使用非参数检验。分类变量以频数(百分比) 表示,两组小鼠之间的存活率比较使用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.小鼠心肌梗死术后存活情况 冠状动脉前降支结扎手术后存活小鼠只数分别为：对照组10只；模型组13只，死亡2只的原因为进针过深刺破心脏引起失血性休克；SP组14只，死亡1只的原因为挤出心脏过程中器械误触破血管导致死亡。术后28d统计各组的存活率为：对照组存活10只(存活率100%)，模型组存活9只(存活率69.23%)，分别在术后3d死亡1只，术后4d死亡2只，5d死亡1只，死亡4只小鼠尸检均发现有血胸认定为是心脏破裂死亡；SP组存活13只(存活率92.85%，与模型组相比P=0.12)，在术后4d死亡1只，尸检发现有血胸，认定为心脏破裂死亡。

2.心功能的改变 MI术后7d检测三组心功能各项指标，其中模型组较对照组的LVEF值和LVFS值显著降低(P<0.01)，而SP组的LVEF值和LVFS值较模型组显著增加(P<0.05)。提示SP处理可以改善心肌梗死后的心功能，结果见表1。

表1 三组小鼠心功能比较

注:与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05

3.心脏重构的情况 心肌梗死后28d心脏组织使用天狼星红染色观察各组心脏梗死瘢痕的面积。发现与假手术组相比，模型组小鼠的梗死瘢痕面积增加(P<0.01)，但是SP组小鼠心脏组织中梗死瘢痕面积显著小于模型小鼠组(P<0.01)。使用WGA染色法观察非梗死区心肌细胞代偿性肥大的情况，发现模型组小鼠的心肌细胞显著大于假手术组(P<0.01)，但是SP组小鼠的心肌细胞显著小于模型组小鼠(P<0.01，图1)。提示SP处理可以减轻心肌梗死后的心脏重构。

图1 精胺处理减轻心肌梗死后的心脏重构程度 A:天狼星红染色观测心肌梗死后瘢痕组织，红色染色为胶原(40x)及胶原阳性面积占左心室面积的比例的统计图。B:WGA染色观测心肌细胞的面积(400×)及心肌细胞横截面面积的统计图。 注: **P<0.01

4.心肌细胞凋亡的情况 心肌梗死后心肌细胞缺血缺氧发生大面积的凋亡，因此我们使用TTC染色法测定了心肌梗死后1d梗死区心肌细胞的活力，并使用realtime-PCR的方法检测凋亡相关基因(Bcl2，Bcl-xL)的表达情况。结果如图2所示，SP组TTC阴性区域面积显著小于模型组(P<0.05)。SP组小鼠心脏组织中抗凋亡基因Bcl2，Bcl-xL的mRNA水平高于模型组(P<0.05)。提示SP处理可减少梗死后心肌细胞因缺氧引起的凋亡。

5.炎症反应 结果如图3所示，SP组小鼠梗死后1天心脏组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA水平均低于模型组小鼠(P<0.05)，同时血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的表达也显著低于模型组小鼠血清(P<0.05)。提示SP处理可以减轻心肌梗死后的炎症反应。

图2 精胺处理促进心肌细胞的存活 A:心肌梗死后1天心脏组织进行TTC染色(红色为存活心肌，白色为已死亡心肌)。B: realtime-PCR法检测Bcl2和Bcl-xL的表达。注:*P<0.05；**P< 0.01

图3 精胺处理减少心脏炎症反应 A:使用realtime-PCR法检测各炎症因子水平。B:使用ELISA 法检测各炎症因子蛋白水平。注:*P<0.05

讨 论

心肌梗死及其并发症(猝死，室壁瘤，心脏破裂，心力衰竭等)严重危害国民健康和生命[5-8]。冠状动脉阻塞引起心肌梗死后，心肌细胞发生凋亡、坏死，活化的肌成纤维细胞产生新的细胞外基质替代梗死心肌形成室壁瘤。但新形成的室壁瘤区域并无有效的收缩功能，为了保证全身供血的有效性，非梗死区存活的心肌细胞会发生代偿性的心肌肥大，从而维持心功能[9]。我们在本研究中发现精胺处理组小鼠在心肌梗死后心功能显著高于模型组小鼠，而且心脏扩张程度小于模型组小鼠。进一步对心脏重构相关的指标的检测结果显示精胺处理组小鼠梗死瘢痕面积小于模型组小鼠，非梗死区心肌细胞代偿性肥大程度低于模型小鼠。以上结果提示精胺可以在心肌梗死后心脏重构过程中发挥保护性作用。

发生心肌梗死后，缺血区心肌细胞由于供氧的缺乏，导致细胞内未折叠或错误折叠蛋白积聚、钙稳态失衡,触发内质网未折叠蛋白反应，激活内质网特异性分子伴侣GRP78并促使真核细胞翻译起始因子2α亚单位eIF2α发生磷酸化,进而使未折叠或错误折叠蛋白恢复正确构象、抑制蛋白质合成,对细胞起保护作用。若应激时间延长则会激活内质网应激凋亡信号通路蛋白capase-12和GADD153/CHOP,诱导细胞发生凋亡坏死[10]。多胺包括腐胺、精脒、精胺，广泛存在于哺乳类动物的各种组织细胞内。近年来研究发现精胺在多种心脏疾病(老年性心肌病、病毒性心肌炎、糖尿病心肌病等)的病理生理过程中起重要作用[11-13]。在脑缺血再灌注损伤过程中，精胺可以通过清除氧自由基，稳定核苷酸从而发挥保护脑的缺血性损伤的作用[14]。在病毒性心肌炎时，精胺可以减少心肌细胞中GRP78的表达，并抑制内质网应激激活的凋亡分子CHOP、caspase-12的表达从而减轻心肌细胞的凋亡和坏死[15]。在本研究中发现精胺处理可减少缺血后心肌细胞的死亡，同时上调抗凋亡分子Bcl-2，Bcl-xL的表达，提示精胺的保护作用主要通过促进心肌细胞在缺血缺氧环境下的存活发挥。

凋亡坏死的心肌细胞可以释放死亡相关模式分子，通过Toll样受体(TLRs)激活成纤维细胞和心脏原位巨噬细胞，促进其释放趋化因子(CCL2，CCL3等)，招募更多的炎症细胞浸润至受损部位[16-17]。坏死的心肌细胞还可以释放TNF-α，IL-6等细胞因子进一步激活招募进心脏的单核巨噬细胞发挥炎症放大作用[18]。心肌梗死后炎症反应一方面可以清除坏死的心肌细胞，另一方面调控心脏重构过程[19]。本研究中发现，与模型组相比，精胺处理可显著降低心脏组织以及循环血清中炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平。证明了精胺可以抑制缺血区的炎症反应，从而在心肌梗死后发挥保护性作用。

综上所述，在小鼠心肌梗死后使用精胺处理可以促进心肌细胞在缺血缺氧环境下的存活，从而减轻心脏炎症反应，进一步减轻心脏重构程度，提高心功能，为心肌梗死的治疗提供新思路。