低温贮藏不同年限的鸭茅种子活力变化

张 旭，聂 刚，黄琳凯，周 洲，唐 露，张新全

(四川农业大学动物科技学院草业科学系，四川 成都 611130)

鸭茅(Dactylisglomerata)又被称为鸡脚草、果园草，系禾本科鸭茅属，原产于欧洲、北非及亚洲温带地区。鸭茅因其极耐阴，适应性好，再生性强，常被用于栽培草地和混播草地建植[1]。同时，鸭茅在岩溶石漠化治理及南方草山草坡改良、草地畜牧业发展中都发挥着重要作用[2]。近年来国家先后提出了“草牧业”及“粮改饲”战略方针，特别是西南石漠化地区治理工程实施后，鸭茅等牧草种子需求日益增加。相对于其他禾本科牧草种子，鸭茅单株小花数多，但结实性和饱满度差，种子偏小，种子清选困难，发芽率相对偏低。有研究表明，国外引进的商品种种子发芽率7-14 d为70%左右[3]，而国内野生栽培驯化品种发芽率在50%左右[4]，田间试验表明，播种20～30 d后仍有少量可相继发芽出苗，其余种子可能因为环境原因导致发育不理想，进而难以发芽出苗[5]。

种子是现代农业中重要的生产资料，种子质量的好坏是保证农业生产的关键因素之一。种质资源能够长期保存是品种改良的前提，种子更是植物种质资源长期保存的理想材料[6]。伴随着种子贮藏时间的延长，种子会不断地老化，使得种子活力持续下降。其中种子贮藏含水量、贮藏温度、贮藏年限一直被认为是影响种子寿命的关键因素[7-9]。抗氧化酶作为细胞内的自由基清除剂，能够降低种子老化过程中自由基对种子细胞膜的攻击，使得细胞膜脂质的过氧化作用降低，从而降低种子老化速率。丙二醛(MDA)是脂质过氧化的终产物之一，是衡量种子老化的关键指标。近年来，在小麦(Triticumaestivum)[10]、油菜(Brassicanapus)[11]、水稻(Oryzasativa)[12]、苜蓿(Medicagosativa)[13]、洋葱(Alliumcepa)[14]、玉米(Zeamays)[15]上许多学者利用高温、高湿、人工加速老化及超干处理等一系列手段来研究种子老化劣变规律。结果表明，人工处理下高温、高湿、高水分的条件能在短时间内使种子膜透性增加，抗氧化酶活性下降，MDA含量上升，种子活力下降。

本研究以低温贮藏不同年限的鸭茅种子为试验材料，对不同贮藏年限的鸭茅种子进行种子质量与酶活性的评价，以期了解鸭茅种子在贮藏过程中的生理变化机制，并找出鸭茅种子贮藏的最佳期限，为种子生产贮藏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为四川农业大学草学系雅安基地2009-2017年的鸭茅种子。贮藏温度为2～4 ℃，种子均收自雅安鸭茅繁种试验地。

1.2 测定指标及方法

1.2.1种子标准发芽率测定 种子发芽率测定参照ISTA(2011)规定[16]进行。选取均匀饱满的鸭茅种子，将其放置于预先铺好3层滤纸的玻璃培养皿中。每个培养皿放置100粒鸭茅种子，4个重复，在20 ℃条件下放置于光照培养箱中培养。初次计数为第7天，末次计数为第15天，分别计算种子发芽势与发芽率：

发芽势=7 d正常发芽种子数/供试种子数(100粒)×100%；

发芽率=15 d正常发芽种子数/供试种子数(100粒)×100%。

1.2.2种子生理生化指标测定 粗酶液提取：取净鸭茅种子0.1 g，在液氮中研磨组织破碎后，待液氮完全挥发后加入预冷磷酸缓冲液提取，斡旋震荡至匀浆，将匀浆在4 ℃，8 000 r·min-1离心10 min，上清液即为粗酶液。将粗酶液分装到各管进行MDA和抗氧化酶活性测定。SOD活性采用核黄素-氮蓝四唑(NBT)光还原法[17]测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法[18]测定，过氧化物酶(POD)采用愈创木酚法[18]测定，MDA采用硫代巴比妥酸法(TBA)比色法测定[19]。

1.3 数据分析

采用EXCEL 2016进行数据录入统计和图表绘制。采用SPSS 19.0进行数据分析，使用Duncan法对不同的年份进行多重比较，用Pearson相关性分析不同贮藏年限的种子活力与生理指标的关系。

2 结果与分析

2.1 贮藏年限对鸭茅种子萌发特性的影响

在4 ℃的低温贮藏条件下，鸭茅种子的发芽势随着贮藏年限的增加大体呈现出先增加再降低的趋势(图1)。其中贮藏前4年总体呈现上升的趋势，至贮藏4年时达到了55.50%，显著高于贮藏1、2、3年(P<0.05)。随着贮藏时间的进一步延长，发芽势呈明显下降趋势，贮藏5年以后，鸭茅的发芽势急剧下降，平均每年下降10%，种子老化加剧。低温贮藏下，在一定的贮藏时间内鸭茅种子的发芽势会维持在较高的水平。

图1 贮藏年限对鸭茅种子萌发特性的影响Fig. 1 Effect of storage duration on germination characteristics of seeds

不同字母表示不同贮藏年限间差异显著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letter indicate significant differences between different storage durations at the 0.05 level; similarly for the following figures.

在4 ℃的低温贮藏条件下，鸭茅种子的发芽率也呈现出先升高再降低的趋势，与发芽势的变化趋势相一致。鸭茅种子发芽率在贮藏的前4年中逐年增高，在第4年时达到最高(67.00%)，且在第7年时出现急剧下降的趋势。可见，在低温的贮藏条件下，鸭茅种子能长期维持较高的发芽率。贮藏7年以后的鸭茅种子发芽率明显降低，显著低于其他各年(P<0.05)，已经不适宜生产利用。值得注意的是，鸭茅在贮藏5年后其发芽势下降趋势比发芽率下降的更快，表明长时间贮藏时发芽势的降低先于发芽率。

2.2 贮藏年限对鸭茅种子抗氧化酶活性的影响

2.2.1贮藏年限对SOD的影响 在4 ℃低温的贮藏条件下，贮藏1、2年的鸭茅种子的SOD活性显著高于其他贮藏年限的鸭茅种子(P<0.05)(图2)。就变化幅度而言，前4年SOD的降速幅度较大，平均每年下降14.85%。随着贮藏时间的延长，SOD活性逐年下降并在贮藏的第5年后SOD活性变化趋于稳定，各年间差异不显著(P>0.05)。SOD作为种子抗氧化酶中的第一道防线，可以歧化O2-生成H2O2。在贮藏的前几年一直保持高活性，使得鸭茅种子在贮藏早期能抵抗劣变对其萌发的影响。伴随着种子老化的加剧，SOD活性逐渐降低。

图2 不同贮藏年限种子SOD活性变化Fig. 2 Changes in the SOD activity of seeds for different storage durations

2.2.2贮藏年限对POD的影响 在4 ℃低温的贮藏条件下，鸭茅种子POD活性呈现了先上升再下降的趋势变化，其中贮藏3年的鸭茅种子POD活性最高，显著高于除贮藏两年外的其他各年的鸭茅种子活性(P<0.05)(图3)。就变化幅度而言，贮藏3年内种子POD活性增幅不明显；但贮藏3年后POD活性的降幅差异明显，年均降幅达15.43%。POD是抗氧化酶中关键的酶之一，在种子贮藏的前几年中提高自身活性来抵抗老化带来的伤害。但随着贮藏年限增加，由于种子自身机能显著降低，难以维持其自身酶活性，呈现急剧下降趋势。

图3 不同贮藏年限种子POD活性变化Fig. 3 Changes in the POD activity of seeds for different storage durations

2.2.3贮藏年限对CAT的影响 在4 ℃的低温贮藏条件下，随着贮藏年限逐年增加，鸭茅种子CAT酶活性呈现出先上升后下降的趋势，并在第5年的时候达到最高，其活性显著高于其他各年(P<0.05)(图4)。就变化幅度而言，前3年间CAT酶活性增加并不明显，但5年内的种子酶活性年均增幅高达10.26%；而从第5年之后，CAT酶活性开始急剧下降，平均降幅达到19.58%。由此可见，作为生物防御体系的关键酶之一，CAT酶在种子贮藏的前几年提高其活性来抵抗自身老化带来的伤害，但随着贮藏年限增加，由于种子自身机能显著降低，难以维持其自身酶活性，呈现急剧下降趋势。

图4 不同贮藏年限种子CAT活性变化Fig. 4 Changes in the CAT activity of seeds for different storage durations

总体上看，3种抗氧化酶均随着贮藏时间的延长而活性降低，SOD活性在贮藏前两年保持最高，并随后降低。POD活性在第3年保持最高，CAT活性在贮藏第5年保持最高。研究表明，种子在低温贮藏中，随着贮藏年限的延长，脂质的过氧化作用增强，为抵抗老化对种子的伤害，通过提高自身的抗氧化酶活性来降低伤害。抗氧化酶之间具有协同作用，分别在不同的贮藏年限中发挥作用。

2.2.4贮藏年限对MDA的影响 MDA含量的高低在一定程度上可以衡量膜质过氧化水平，在4 ℃低温的贮藏条件下，鸭茅种子MDA含量随着贮藏年限的延长出现了缓慢上升的趋势(图5)。在前3年内的贮藏年限中，呈现显著上升的趋势(P<0.05)，随着贮藏年限的进一步延长MDA含量变化不明显，呈现上升的趋势。值得注意的是，MDA含量与种子的发芽势及发芽率呈负相关关系(表1)，说明MDA虽对鸭茅种子的正常膜结构造成了一定的影响，但与种子的萌发的相关关系不显著。

图5 不同贮藏年限种子MDA含量变化Fig. 5 Change in the MDA content of seeds for different storage durations

测试指标Test index发芽势Germination potential发芽率Germination rateSOD活性SOD activityPOD活性POD activityCAT活性CAT activityMDA含量MDA content发芽势Germination potential1.000发芽率Germination rate0.936**1.000SOD活性SOD activity0.9950.8421.000POD活性POD activity0.832**0.808**0.3421.000CAT活性CAT activity0.847**0.918**-0.1980.695*1.000MDA含量 MDA content-0.402-0.296-0.739*-0.489-0.0331.000

*表示在0.05水平上显著相关，**在0.01水平上极显著相关。

* and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 level, respectively.

2.3 不同贮藏年限种子萌发指标与生理指标的相关性分析

在种子老化过程中，种子的发芽势、发芽率是评价种子生活力的指标。SOD、CAT和POD这3种酶是细胞抗氧化系统中的重要组成，能够协同作用防止种子的过氧化。低温下不同贮藏年限的鸭茅种子活力与MDA含量均呈负相关关系，但不显著(表1)。POD活性和CAT活性与种子活力呈极显著正相关关系(P<0.01)。在低温贮藏的条件下，种子活力与抗氧化酶活性变化关系密切。抗氧化酶是衡量种子种用价值的重要指标，抗氧化酶活性的降低意味着种子活力下降，种子种用价值降低。

3 讨论

本研究选用了在低温条件下9种不同贮藏年限的鸭茅种子，通过测定其种子萌发指标和抗氧化酶活性进行种子劣变评价，得出了鸭茅适宜的贮藏年限为5年。本研究表明，鸭茅种子发芽率、发芽势在低温保存下，一定年限内能稳定萌发，保持较高的发芽率和发芽势，但是随着贮藏年限的增加，种子劣变加速，其发芽指标呈现降低的变化趋势。前人在羊草(Leymuschinensis)[20]、结缕草(Zoysiajaponica)[21]、狗牙根(Cynodondactylon)[22]、披碱草(Elymusdahuricus)[23]和老芒麦(Elymussibiricus)[24]等种子老化研究中，自然条件下贮藏的种子在2～3年后种子活力急剧下降，基本丧失利用价值。本研究采用的是低温贮藏的种子材料，结果表明低温贮藏较自然条件下贮藏种子活力下降明显变缓，贮藏时间更久。

相关报道表明，种子老化常伴随着酶活性的变化，SOD、CAT、POD是细胞内的3种酶活性氧清除剂。保护生物膜系统免受活性氧自由基损伤，活性越高，说明种子的抗逆能力越强[25]。其中SOD可以歧化O2-生成H2O2。CAT和POD则是H2O2的清除剂。三者协同作用，保护鸭茅种子生物膜。本研究表明，在一定的贮藏年限内，鸭茅种子内的CAT、POD活性都呈上升趋势，在5年内的贮藏时间里，表现出了一定的协同作用，其活性分别在不同年限达到最高。其中SOD作为抵御氧化逆境自由基形成的第一道防线，在贮藏的前两年，SOD表现出的较高的活性，以O2-为基质进行歧化反应转化为H2O2。清除了活性氧的毒害，减轻脂质过氧化作用[26-28]。随着老化程度的加剧，逆境胁迫加重，SOD活性被H2O2抑制，活性下降，POD的活性被激活，形成了第二道防线，在贮藏3年时POD活性达到峰值，相关性分析表明，POD与种子活力极显著正相关。伴随着老化程度的加强，CAT活性逐步升高，在贮藏5年时，CAT活性达到最高(P<0.05)。CAT具有较强的催化能力，是植物氧化和抗氧化的关键酶，可以专一清除H2O2[29]。相关性分析表明，CAT与种子活力极显著相关。在贮藏5年以后，SOD、POD、CAT活性水平均大幅下降，这与Jeng和Sung[30]、姜义宝等[31]研究一致。这是因为老化劣变加深使得酶促抗氧化系统自身遭受了损害，种子劣变程度加剧，活力下降，其种用价值降低。

MDA是脂质过氧化的终产物之一，它对种子有毒害作用，可以作为逆境胁迫程度的指示[32]。本研究中，MDA的含量随着贮藏年限的增加逐步上升，这与前人[27,33]研究基本一致。老化使得鸭茅种子的MDA含量逐渐增加，但与种子的发芽势、发芽率没有显著的相关性，可能供试种子是在低温条件下贮藏的，且试验年限较短，不能很好地反映出MDA含量与萌发指标的明显关系[34]。

4 结论

低温贮藏中，SOD、CAT和POD活性是影响鸭茅种子萌发的关键因素。种子的发芽势和发芽率较高时，其种子内的抗氧化酶活性也较高，随着老化加剧，种子活力逐步丧失。低温贮藏条件下，鸭茅种子表现出了较强的耐贮性，种子的最长贮藏年限可达5年，5年后种子劣变加剧，其种用价值降低。本研究中MDA含量高低并不能很好地表现出对鸭茅种子萌发的影响。