接头蛋白CrkⅡ在喉鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

姚芝芬，于 明，朱 颖，龚正鹏

(贵州医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科，贵阳 550004)

据统计2015年我国喉癌新发病例约2.64万人，约1.45万人因喉癌死亡[1]。喉癌治疗仍以手术为主，近年来，喉癌的治疗理念已经从根治为主转向尽可能保留喉功能，在提高生存率的同时不断提高患者的生活质量[2]。因此，迫切需要新的治疗靶点。研究显示，接头蛋白CrkⅡ蛋白在多种不同来源的恶性肿瘤中过表达，与肿瘤的发生发展密切相关[3]。对于喉鳞状细胞癌，CrkⅡ的表达及其临床意义仍然未知。本研究主要是检测CrkⅡ在喉鳞状细胞癌中的表达，并分析CrkⅡ表达与临床病理特征的关系，探讨CrkⅡ在喉鳞状细胞癌发生发展中的意义，以寻求新的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 标本均来自贵州医科大学附属医院2006年6月至2012年10月病理科石蜡存档标本，经病理科诊断为喉鳞状细胞癌，术前均未行放疗及化疗。共54例，其中男53例，女1例，年龄36～73岁，平均57岁。按UICC(2002) TNM分期标准，Ⅰ期19例，Ⅱ期12例，Ⅲ期8例，Ⅳ期15例。按WHO肿瘤分型标准，病理分级为高、中、低分化各有29、20、5例。有颈淋巴结转移者12例。另22例癌旁正常组织作为对照。所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。

1.2主要试剂 兔抗人CrkⅡ多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，DAB试剂盒及PV-6001购于北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.3方法 免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法，抗体浓度1∶130，阳性对照为卵巢癌组织，阴性对照以PBS代替一抗。具体步骤：(1)石蜡切片置于60 ℃恒温箱，烤片60 min；(2)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号中分别浸泡10 min脱蜡；(3)100%、95%、80%乙醇中各浸泡5 min至水，蒸馏水洗3次，每次5 min；(4)3% H2O2水室温孵育10 min清除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗3次，每次5 min；(5)抗原修复：切片浸入0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液中，高压锅加热至沸腾，小阀门升起后3 min，PBS洗3次，每次5 min；(6)山羊血清按1∶10稀释、封闭、室温孵育20 min；(7)滴加一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5 min；(8)孵育二抗，37 ℃恒温水箱20 min，PBS洗3次，每次5 min；(9)DAB显色，在白色背景下一旦变成棕色立即自来水冲洗终止反应，蒸馏水冲洗10 min；(10)复染、脱水、透明、封片。

1.4结果判定 CrkⅡ蛋白主要在细胞质表达,细胞核可见少量表达,因此以细胞质或/和细胞核内出现棕黄色颗粒视为阳性细胞。(1)选择5个高倍视野(400×)计数肿瘤细胞总数和阳性细胞个数,得出阳性细胞百分率,≤5%计0分，6%～25%计1分,26%～50%计2分,51%～75%计3分,>75%计4分。(2)着色强度为多数阳性细胞呈现的染色,细胞无染色为0分，浅棕色为1分,棕色为2分,深棕色为3分。(3)总评分：两项评分相加，≥3分为阳性，<3分为阴性。

1.5统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计数资料采用率表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CrkⅡ在喉癌组织和癌旁正常组织中的表达情况 免疫组织化学SP法结果示CrkⅡ在喉癌组织中主要表达于细胞质及细胞膜，细胞核可见少量表达，阳性率达68.5%，在癌旁正常组织中少量表达或无表达，喉癌组织CrkⅡ阳性率与癌旁正常组织比较差异有统计学意义(χ2=4.180，P<0.05)，见图1、表1。

A:癌旁正常组织(×200)；B:喉癌组织(×400)

表2 CrkⅡ在喉癌组织中的表达与临床病理特征的关系

2.2CrkⅡ蛋白与喉鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系 喉癌组织中，CrkⅡ蛋白在中、低分化的肿瘤标本中阳性表达率明显高于高分化(χ2=5.172，P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ期的CrkⅡ蛋白阳性率与Ⅰ、Ⅱ期比较显著增高(χ2=9.643，P<0.05)，有淋巴结转移者CrkⅡ蛋白阳性表达率为91.7%，与无淋巴结转移者的61.9%比较差异有统计学意义(χ2=3.833，P<0.05)，但CrkⅡ蛋白的阳性表达率在喉癌患者各年龄组中差异无统计学意义(χ2=0.541，P>0.05)，见表2。

3 讨 论

原癌基因Crk定位于染色体17p13.3，其表达产物CrkⅡ蛋白相对分子质量为40×103，为接头蛋白Crk家族的成员，介导蛋白质-蛋白质间相互作用，并在细胞内信号转导中起重要作用。CrkⅡ由3个Src同源(sarcoma homology,SH)结构域组成：SH2、N-末端SH3(nSH3)和C-末端SH3(cSH3)结构域。CrkⅡ-SH2结构域与蛋白质中磷酸化的酪氨酸模体结合，包括p130Cas、桩蛋白和Gab1等；CrkⅡ-nSH3结构域与富含脯氨酸基序的蛋白相互作用，包括C3G、Dock180、c-Abl、Cbl和JNK等；CrkⅡ-cSH3是一种非典型SH3结构域，不与脯氨酸基序结合，可反向激活Abl。这些蛋白涉及细胞增殖、迁移、侵袭和细胞骨架重构，基于这些信号转导分子的相互作用，CrkⅡ的作用涉及调节细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭、骨架重构等[4-5]。

CrkⅡ蛋白在胚胎和成人各组织中普遍少量表达，在多种肿瘤组织中过表达,如肺癌、成胶质母细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌和膀胱癌等，通过信号转导参与肿瘤细胞的增殖、分化、转移和侵袭[6-10]。

YAMADA等[11]用免疫组织化学检测71例口腔鳞状细胞癌(OSCC)标本中CrkⅡ的表达。在正常上皮中没有检测到CrkⅡ的表达,而在OSCC的侵袭性前缘和弥漫性侵袭性区域见CrkⅡ强染色。在OSCC中CrkⅡ过表达(49/71，68.1%)较正常的口腔上皮细胞(0/10，0，P<0.05)更多见。 此外，在晚期癌症组织中CrkⅡ过度表达更明显，如T分期中(T3/4vs. T1/2,P<0.05)，N分期中(N3/4vs. 1/2，P<0.05)和侵袭性模式中(3/4vs. 1/2，P<0.01)[12]。LIU等[9]用免疫组织化学探索CrkⅡ在胰腺导管腺癌(PDAC)组织中的表达谱。在150个PDAC组织中发现126例高度表达CrkⅡ蛋白。而CrkⅡ蛋白在周围的正常组织中几乎无表达。

本研究结果显示，CrkⅡ蛋白于喉鳞状细胞癌组织中阳性表达率约68.5%，显著高于癌旁正常组织，提示CrkⅡ与喉鳞状细胞癌的发生发展有关。与其他肿瘤的相关研究一致，随着肿瘤病理分级、临床分期的递增及淋巴结的转移，CrkⅡ蛋白阳性表达率和着色强度也在递增。均提示CrkⅡ蛋白通过促进癌细胞的侵袭、转移在喉鳞状细胞癌的发展过程中发挥重要作用。CrkⅡ有望作为喉鳞状细胞癌检测及治疗的新指标，然而具体的作用机制仍有待进一步研究。