不同干燥方式对桑葚渣提取物主要活性成分及 α-淀粉酶抑制活性的影响

范铭，刘哲，曹艳，陆胜民,*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004； 2.浙江省农业科学院食品科学研究所， 浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310021)

桑葚属于桑科，被列入药食同源名录，鲜果味道甜美、多汁，含有人体所必需的营养素如维生素、氨基酸、矿物质以及具有生理活性的花色苷、黄酮、酚酸类化合物。大量研究表明，桑葚提取物在降血糖、增强免疫、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等方面有显著的作用[1-2]。目前，桑葚的加工主要以制作果汁为主，少量用于酿造果酒、果醋，榨汁后所产生的果渣一般被废弃，造成环境污染和资源浪费。然而桑葚渣中仍残留大量花色苷、多酚和黄酮等活性成分，因此可用于开发营养健康食品[3]。由于水分含量和残糖量均较高，桑葚渣极易变质和腐败，需要对其进行及时干燥处理或冷冻保存。本文主要考察不同干燥方式和乙醇提取浓度对桑葚渣中主要功能成分和α-淀粉酶抑制率的影响，为桑葚渣开发成具有降糖活性的产品提供技术和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为桑葚品种大十，采摘于浙江省安吉县梅溪镇马村。榨汁后的桑葚渣以每袋500 g进行分装，保存于-20 ℃的冰箱中，备用。

1.2 仪器

DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验室备有限公司)；SCIENTZ-18N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BJ-300多功能粉碎机(拜杰公司)；电子天平；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LXJ-ⅡB型离心机(上海安亭科学仪器厂)；RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；UV-1800紫外分光光度计(日本岛津公司)；DK-8D电热恒温水槽(上海精宏实验室备有限公司)。

1.3 试剂

乙醇、盐酸、氯化钾、冰乙酸、无水乙酸钠、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、福林酚、没食子酸、碳酸钠、可溶性淀粉、阿卡波糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等购于上海国药集团；α-淀粉酶(猪胰腺淀粉酶)购于源叶生物公司。

1.4 桑葚渣的干燥处理

热风干燥。称取在-20 ℃中冷冻的桑葚渣(含水量89%)500 g平铺于托盘中，鼓风干燥箱中干燥至恒重。干燥条件为50 ℃、48 h。将干燥后的桑葚渣研磨过100目筛(孔径0.149 mm)，保藏于-40 ℃冷冻冰箱中。

冷冻干燥。称取在-20 ℃中冷冻的桑葚渣500 g，在-80 ℃预冻1 d，再冷冻干燥。冻干条件：在-80 ℃预冻24 h，再进真空冷冻干燥至恒重，阱温度-40 ℃左右，真空度0.025 MPa，干燥72 h。将干燥后的桑葚渣研磨过筛，保藏于-40 ℃冷冻冰箱中。

1.5 提取工艺

取冷冻干燥、热风干燥后的桑葚渣粉各20 g，用乙醇浓度为0、20%、40%、60%、80%，料液比为1∶10进行超声提取，超声条件为功率500 w、温度60 ℃，提取时间为30 min，提取液在4 000 r·min-1离心20 min，取上清。上述过程重复2次，合并滤液。

1.6 提取液中活性成分的测定

1.6.1 总黄酮含量

参照文献[4]。

标准曲线的建立。精密称取无水芦丁标准品适量，加无水乙醇制成0.2 mg·mL-1的标准品溶液。精密吸取该溶液1、2、3、4、5、6 mL分别置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液1 mL,摇匀，静置6 min，加NaOH溶液10 mL，摇匀，加水至刻度，放置15 min，在509 nm波长处测定吸光值。平行试验2～3次。

样品的测定。精密吸取提取液2.5 mL置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加NaOH溶液10 mL, 摇匀，加水至刻度，放置15 min，在509 nm波长处测定吸光值，以蒸馏水做空白。

现在家长对于孩子发热越来越恐惧了，因此孩子只要发热或者发热持续一天或两天，家长就会带孩子反复去医院就诊或者在家私自用药，不但让孩子成了药罐子，同时也埋下耐药的隐患，而且还容易贻误病情。为什么家长会有这种表现呢？这主要源于对发热缺乏正确的认识。

1.6.2 总酚含量

参照文献[5]。

标准曲线的制作。分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL浓度为0.1 mg·mL-1的没食子酸标准溶液于25 mL容量瓶中，加入2.5 mL Folin Ciocalteu显色剂，摇匀；再加入5 mL 5%Na2CO3溶液，加水定容，在40 ℃下避光放置40 min，在750 nm处测定其吸光值。

样品处理。取1 mL提取液，加入9 mL蒸馏水混匀，加入2.5 mL Folin Ciocalteu显色剂，摇匀；再加入5 mL 5% Na2CO3溶液，加水定容，在40 ℃下避光放置40 min，在750 nm处测定其吸光值。平行试验2～3次。

1.6.3 总花色苷含量

各取1 mL样品分别加入9 mL pH 1.0的缓冲液(KCl-HCl)和pH 4.5的缓冲液(NaAc-HCl)，分别在510 nm和700 nm处测定其吸光值[6]。平行试验2～3次。

1.7 α-淀粉酶活性抑制试验

α-淀粉酶是淀粉消化过程中的一种关键酶，水解淀粉结构中的α-1,4糖苷键。α-淀粉酶抑制剂能通过抑制肠道内唾液和 α-胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的消化吸收，可有效控制餐后血糖的升高，间接减少体内脂肪的合成，延缓糖尿病的发生和发展。相比于动物和细胞试验来说，α-淀粉酶活性抑制试验具有成本较低、操作简便和可控性强等优点。因此本试验选用α-淀粉酶活性抑制试验来研究桑葚的降糖活性[7]。

1.8 数据统计

用Excel 2010、SPSS 17.0进行数据分析。试验重复3次以上，试验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 对桑葚渣醇提液活性成分含量的影响

分别选取热风干燥、冷冻干燥后的桑葚粉为原料，以不同浓度的乙醇溶液(20%、40%、60%、80%)作为提取溶剂，测定各组提取液中总酚、总黄酮、总花色苷的含量。

由表1可知，采用不同方式干燥的桑葚渣在乙醇中释放活性成分的规律相同，活性成分含量均随乙醇浓度的增加先增加后下降，且不同乙醇浓度的桑葚提取液中总黄酮、总酚、总花色苷的含量均呈现显著性差异。当乙醇体积分数达到60%时，桑葚的活性成分含量达到最大，可能是由于乙醇体积分数小于60%时，提取剂的极性有利于多酚、黄酮、花色苷的溶解，当乙醇体积分数继续增加时，提取剂的极性偏弱，不利于多酚、黄酮、花色苷的溶解。这与邢小丽等[4-6]研究的规律一致。而冷冻干燥的桑葚渣在相同乙醇浓度所提取出的活性成分含量远高于热风干燥的桑葚渣，特别是总花色苷的含量，可能由于花色苷极易氧化，冷冻干燥过程中较低的温度和氧气含量会降低花色苷的损失，而热风干燥暴露在空气中的时间较长，多酚、黄酮、花色苷都易被氧化[9]，所以在冷冻干燥过程中活性物质损失少。因此，冷冻干燥能更好地保存桑葚的活性物质。

表1 不同干燥方式的桑葚渣醇提液中活性成分含量

注：相同干燥方式同列无相同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2.2 对桑葚渣醇提液抑制α-淀粉酶活性的影响

选取不同浓度乙醇水溶液(20%、40%、60%、80%)为提取剂，探究经冷冻干燥、热风干燥处理的桑葚渣在各浓度的乙醇水溶液下对α-淀粉酶的抑制活性。

由图1可知，2种处理方式的醇提液对α-淀粉酶的抑制活性的规律相似，均随着乙醇体积分数的增大先增高后趋于平稳，在浓度为40%时，抑制效果最佳。热风干燥在乙醇体积分数为40%、60%、80%时的提取液对α-淀粉酶的抑制率在64%～67%，互相之间无显著性差异；冷冻干燥在40%、60%、80%时的提取液对α-淀粉酶的抑制率在61%～66%，互相之间无显著性差异。桑葚中所含的降糖活性成分中包括槲皮素，据文献报道，槲皮素几乎不溶于水，其降糖效果较好，因此在桑葚醇提物中可能槲皮素起主要降糖作用[10-11]，40%的乙醇有利于槲皮素的溶出，因此浓度的提升不会使得降糖活性提高。对比表1的总黄酮、总酚、总花色苷的含量，冷冻干燥活性物质含量显著高于热风干燥活性物质含量，但在乙醇浓度相同的条件下，热风干燥的降糖活性较冷冻干燥的降糖活性稍好(显著性未在图中标出，但通过SPSS分析，20%、40%乙醇体积分数的2种处理方式的桑葚提取液对α-淀粉酶的抑制率存在显著性差异，60%、80%的乙醇浓度2种处理方式的桑葚提取液对α-淀粉酶的抑制率不存在显著性差异，可能是由于热风干燥的醇提物中除槲皮素外还有热风干燥在加热过程中产生的酚类物质。据报道[12]，非强热的加热过程可能会导致酚类物质的前体酚醛分子非酶转化成酚类物质，加热所生成的酚类物质可能具有较高的降糖活性，所以导致乙醇作为提取剂，热风干燥的降糖活性要略高于冷冻干燥的降糖活性。

同乙醇体积分数无相同小写字母表示2种干燥方式差异显著(P<0.05)图1 不同干燥方式的桑葚渣醇提液对α-淀粉酶的 活性的影响

2.3 对桑葚渣水提液活性成分含量的影响

选取热风干燥、冷冻干燥后的桑葚粉，以水作为提取溶剂，探究在蒸馏水的提取下活性因子的含量，结果如表2。

表2 不同干燥方式的桑葚渣水提液中 活性成分含量

注：同列无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表2可知，2种干燥方式处理后的桑葚渣经水提取后，提取液中活性成分含量存在显著差异。冷冻干燥后的桑葚渣水提液中的总黄酮、总酚和总花色苷含量显著高于热风干燥后桑葚渣水提液的含量，分别是热风干燥桑葚水提液的1.76、1.49、3.60倍。这可能是由于冷冻干燥温度低且含氧量少，可减少总黄酮、总酚和总花色苷的氧化，特别是易氧化的花色苷[9]。对比表1，桑葚水提液的活性成分含量低于桑葚醇提液中活性成分含量，这可能是由于黄酮、多酚、花色苷更易溶于醇，所以醇提液的活性物质含量要高于水提液的活性物质含量。

2.4 对桑葚渣水提液抑制α-淀粉酶活性的影响

由图2可知，热风干燥处理的桑葚渣水提液对α-淀粉酶的抑制率为70.3%，冷冻干燥处理的桑葚渣水提液对α-淀粉酶的抑制率为58.3%，两者存在显著性差异，但都显著低于阳性对照阿卡波糖。冷冻干燥的桑葚渣水提液对α-淀粉酶的抑制率低于热风干燥的桑葚渣水提液对α-淀粉酶的抑制率，可能是由于热风干燥在加热过程中生成了具有较高降糖活性的酚类物质[12]。据文献报道[10-11]，花色苷也具有降糖的功效，但起主要降糖效果的物质可能为酚类物质，所以冷冻干燥的桑葚渣水提液中的花色苷虽然比热风干燥的桑葚水提液花色苷高出很多，但降糖效果却不及热风干燥后的桑葚渣。

无相同小写字母表示处理方式间差异显著(P<0.05)图2 不同处理方式的水提液对α-淀粉酶的 抑制效果

对比表1、图1、表2、图2发现，热风干燥后桑葚渣水提液中的活性物质含量最低，但降糖活性略高于热风干燥醇提液，可能是由于桑葚水提液和醇提液中具有降糖活性的物质不同。醇提有利于槲皮素的释放，槲皮素具有良好的降糖效果，桑葚醇提液中可能是槲皮素起主要降糖作用[10]。而热风干燥以及水提都能释放酚类物质，酚类物质也可能与其他化学物质之间存在协同作用[11]，使得桑葚水提液的降糖活性与醇提液的降糖活性相当。而冷冻干燥的桑葚水提液中只有水提得到的具有较高的降糖活性的物质，因此冷冻干燥的桑葚水提液的降糖活性不及醇提液的降糖活性。综上，热风干燥的桑葚渣选择水作为提取剂，冷冻干燥选择体积分数为40%的乙醇作为提取剂。

3 小结

热风干燥、冷冻干燥的桑葚活性物质的释放规律都是在乙醇体积达到60%时，活性物质释放最多，这种规律可能和处理方式关系不大，而与提取剂的极性相关。桑葚中具有降糖活性的物质分为水溶性和醇溶性2部分，且降糖活性相差不大，导致桑葚水提物和醇提物具有相当的α-淀粉酶抑制活性。虽然冷冻干燥后的桑葚渣中，活性成分含量均显著高于热风干燥后的桑葚渣，但α-淀粉酶抑制活性相差不大，表明热风干燥过程中生成了少量的性质比较稳定的活性成分，如酚类化合物。因此，在实际应用中可根据产品需求对桑葚渣采取合适的干燥处理和提取方式，提高桑葚渣的利用率。