不同发酵度茶叶提取物对结直肠癌细胞HCT116增殖的影响

李艳晖，刘妙玲，吕思慧，苏晗涛，孙海燕

（深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东 深圳 518055）

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，且具有相当高的致死率。《2014年世界癌症报告》表明，在所有癌症中结直肠癌的全球病发率居第3位［1］。而富含饱和脂肪酸的饮食结构是导致结直肠癌的重要因素之一［2］。目前临床针对结直肠癌的治疗多以手术和传统化学合成药物为主的综合治疗，尽管治疗手段取得一定突破，但治疗后患者生存率仍较低，且治疗药物存在副作用大、非特异性强、耐药等问题，发现作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗结直肠癌药物是目前药物研究发展的重要方向。已有研究发现，在天然植物的提取成分中发现了酚酸等物质能阻止结直肠癌的前驱病变异常隐窝灶的形成［3］。茶叶作为一种天然植物，在世界各地人民的饮食习惯中十分普遍，其抗癌作用也受到人们的关注。

茶多酚是茶叶浸出物中含量高的抗氧化物质。细胞和动物试验研究均表明，茶多酚能够有效降低肿瘤发生率、抑制肿瘤细胞增殖以及促进肿瘤细胞凋亡［4-8］。但茶多酚是否具有抗结直肠癌作用目前尚无定论。另外，人们按茶叶加工发酵的方式与程度划分成不发酵茶、半发酵茶、全发酵茶，不同发酵程度茶浸提液主要功能性成分含量差异较大［9］，且有研究表明不同加工形式茶叶中茶多酚等功能性成分含量和抗氧化活性有相关性［9-10］。但有关不同发酵程度茶叶中茶多酚对结直肠癌细胞作用方面的研究目前尚无报道。为研究不同发酵程度茶叶中茶多酚提取物对结直肠癌细胞的影响，本研究采用未发酵茶（黄山毛峰）、半发酵茶（大红袍）、全发酵茶（祁门红茶），探究不同发酵程度茶叶中的茶多酚提取物对结直肠癌HCT116细胞增殖的影响，以期拓宽茶叶用途、为其作为天然药物治疗癌症提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人结直肠癌细胞株HCT116由广东省胃肠病学研究所（广东省结直肠盆底疾病研究重点实验室）刘焕亮教授课题组赠送；黄山毛峰、大红袍、祁门红茶（属二级茶叶，分别烘干、打粉、过孔径0.18 mm筛，自封袋封好放干燥器中避光备用。

供试药剂包括：RPMI-1640培养基、Penicillin-Streptomycin双抗、澳洲特级胎牛血清（FBS）、0.05%Trypsin-EDTA（1X）（美国GIBCO公司），二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司），MTS（Promega公司），其余试剂均为国产分析纯。

仪器设备包括：HERAcell240型细胞培养箱（美国Thermo公司），多功能酶标仪SpectraMax® M5e（ 美 国 Molecular Devices），LeicaDMIRB倒置生物荧光显微镜（德国Leica公司），5430-R低温高速离心机、5810-R低温高速离心机（德国Eppendorf公司），SWCJ-2FD型洁净工作台（苏州苏净集团安泰公司），全自动手持式细胞计数器Scepter™、细胞计数芯片 Scepter™ Sensors-60µm（美国Millipore公司），25 cm2细胞培养瓶、96-well细胞培养板（透明）、15 mL离心管、50 mL离心管、0.45 µm滤膜、1.5 mL EP离心管（美国Corning Costar公司），电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），EPED-E2-20TS型实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养条件 从液氮罐中取出冷冻管，迅速放进37℃水浴溶解，然后在无菌条件下将细胞转移到1.5 mL EP离心管，600 r/min离心5 min，弃去上清液，加入1 mL RPMI-1640培养液（内含10%胎牛血清和1%双抗，下同）重悬细胞，加入4～5 mL RPMI-1640培养液和1 mL重悬细胞液于25 cm2细胞培养瓶，置于37℃、5%CO2恒温箱静置培养。

人结直肠癌细胞株HCT116，体外培养于RPMI-1640培养基（内含10%,胎牛血清、100 U/mL链霉素、100 U/mL青霉素），置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下常规培养。

12.2 茶多酚提取方法 取20 g已处理的茶叶粉末，加入500 mL 70%甲醇，冷凝回流浸提30 min（重复浸提3次），合并滤液，将其旋转蒸发至原体积的15%～20%，然后用3倍体积氯仿萃取1次，再次旋转蒸发，将其旋转蒸发至萃取后体积的5%左右，剩余部分溶解于超纯水中。15 000 r/min离心20 min，取上清液，真空冷冻干燥，常温避光保存。

1.2.3 茶多酚提取物总多酚含量测定 总多酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法［11］，以没食子酸为标准品，用分光光度计进行测定。分别精确称取所提取的黄山毛峰、大红袍、祁门红茶茶多酚粗粉适量，定容至合适体积。取100 µL样品（可作适当稀释）和400 µL超纯水，加入0.1 mL福林酚试剂混匀后，静置6 min。根据没食子酸标准曲线回归方程计算待检样品中酚类物质的含量，茶多酚含量以每克茶多酚粗粉中所含的没食子酸当量（mg /g，DW）表示。每个样品3次重复。

1.2.4 HCT116细胞存活率测定 采用MTS还原反应测定HCT116细胞的存活率。取对数生长期的人结直肠癌细胞株HCT116胰酶消化后，人结直肠癌细胞HCT116培养液重悬，取2.5×105个细胞，调整浓度为5×104个/mL，以100 µL/孔接种于96孔板孔内。各处理分别加入5、15、25、35 µg/mL浓度梯度的3种茶多酚于HCT116细胞中，每个浓度处理3次重复；空白对照（无接种细胞）、对照（有接种细胞）各加入不含茶多酚的等体积无血清无双抗的细胞培养液；置于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h，然后避光，每孔各加入10 µL MTS孵育，4 h后用酶标仪在490 nm波长处检测吸收度（A）值，计算抑制率并用Graphpad Prism 5.0软件计算药物处理细胞后达半数抑制的药物浓度IC50。

1.2.5 细胞形态学观察 将对照及药物处理72 h后的细胞置于LeicaDMIRB倒置生物荧光显微镜的10倍光学显微镜下，进行细胞形态观察和比较。选取对照、15 µg/mL、35 µg/mL等3个茶多酚浓度的细胞进行观察并拍照。

试验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析，多样本均数比较采用单因素方差分析［5］。

2 结果与分析

2.1 茶多酚提取物总多酚含量测定

根据标准曲线计算得出，黄山毛峰、大红袍、祁门红茶茶多酚提取物中总多酚含量分别为434.11（±8.76）、401.94（±2.90）、282.19（±6.47 ）mg GAE/g。

2.2 不同发酵程度茶叶茶多酚对HCT116细胞增殖的影响

从表1可以看出，当黄山毛峰茶多酚提取物浓度在5～25 µg/mL范围时，HCT116细胞抑制率随着其浓度的上升而上升，且与对照相比差异极显著，说明黄山毛峰茶多酚提取物对结直肠癌HCT116细胞增殖有明显的抑制作用，且作用强度随浓度的增大而增大；茶多酚提取物浓度为25 µg/mL时，HCT116细胞的抑制率最大（73.66%，P＜0.01），抑制效果显著。当大红袍茶多酚提取物浓度在5～35 µg/mL范围时，HCT116细胞抑制率随着其浓度的上升而上升，且与对照相比差异极显著，表明大红袍茶多酚提取物对结直肠癌HCT116细胞增殖有明显的抑制作用，且具有量效相关性；茶多酚提取物浓度为35 µg/mL时，HCT116细胞的抑制率最大（54.65%，P＜0.01），抑制效果明显。祁门红茶茶多酚提取物浓度在5～35 µg/mL范围时，HCT116细胞出现不同程度的抑制，与对照比较差异显著，表明祁门红茶茶多酚提取物处理HCT116细胞72 h后呈现一定量效相关性；茶多酚浓度为35 µg/mL时，HCT116细胞的抑制率最大（55.05%，P＜0.01），具有一定抑制效果。

表1 3种茶叶茶多酚提取物对HCT116细胞的抑制率（%）

浓度在5～35 µg/mL范围时，3种不同发酵程度茶叶中的茶多酚提取物均对HCT116细胞的增殖有显著抑制作用。从图1可以看出，黄山毛峰、大红袍、祁门红茶茶多酚提取物作用HCT116细胞72 h的IC50分别是11.86、21.46、30.96 µg/mL，处理间差异显著。3种茶多酚提取物对HCT116细胞作用的IC50值大小比较如下：未发酵茶黄山毛峰茶多酚提取物IC50＜半发酵茶大红袍茶多酚提取物IC50＜全发酵茶祁门红茶茶多酚提取物IC50。表明随着茶叶发酵程度的增加，对HCT116细胞增殖的抑制作用减弱。

图1 不同茶叶茶多酚提取物作用HCT116细胞72 h后的IC50值

2.3 细胞形态学观察不同发酵程度茶叶茶多酚对HCT116细胞的抑制作用

从图2可以看出，黄山毛峰对照的细胞贴壁生长，生长状态良好，透明度大，折光性强，且细胞数量较多；15 µg/mL黄山毛峰茶多酚提取物处理后的细胞，相较于对照来说，有少数的细胞萎缩变圆，有凋亡小体出现；35 µg/mL黄山毛峰茶多酚提取物处理后的细胞，生长状况差，折光性弱，绝大部分贴壁细胞皱缩成圆形，细胞间质消失，凋亡小体增多，细胞数量大幅减少，与对照相比有显著差异。大红袍茶对照的细胞生长状态良好，细胞较密集；15 µg/mL大红袍茶多酚提取物处理后的细胞，相较对照有少数细胞皱缩成圆形，出现凋亡小体，细胞数量相对减少；35 µg/mL大红袍茶多酚提取物处理后的细胞大部分皱缩、变圆，体积缩小，细胞不连成片状，细胞大量减少，与对照相比有明显差异。祁门红茶对照细胞处于贴壁生长状态，呈现无色透明，连成片状且细胞较密集；15 µg/mL祁门茶多酚提取物处理后的细胞，出现少量细胞皱缩，变圆，细胞数量相对减少；35 µg/mL祁门茶多酚提取物处理后的细胞皱缩，变圆，体积缩小，细胞数量减少。

图2 不同茶叶茶多酚提取物作用72 h后的HCT116细胞（10×10）

可见，在35 µg/mL的相同浓度下，不同发酵程度茶叶茶多酚提取物对细胞形态影响程度不同。黄山毛峰和大红袍茶多酚提取物处理后的细胞数量相较对照组明显减少，贴壁细胞形态大多数皱缩、变圆，生长状况差，折光性差，产生大量凋亡小体。祁门红茶茶多酚提取物处理后的细胞相较上述两组，数量减少程度最小，形态改变程度最小。

3 结论与讨论

茶多酚是茶叶中最主要的活性成分，包括儿茶素、黄酮类、酚酸类、花青素等。其中儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，约占茶多酚总量的70%～80%，主要含有儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子酸儿茶素（EGC）以及表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）等多种活性物质［12］。虽然在不同种类茶叶中，茶多酚类物质均为主要化学成分［13］，但不同品种、不同产地、不同品质茶叶中茶多酚提取物的含量、组成成分却有较大区别［14-16］。茶叶加工方式，尤其是发酵过程会对茶叶茶多酚组成成分产生极大影响［17］。茶多酚提取物的活性作用主要是由不同构成成分综合作用的结果［18-19］。本研究对黄山毛峰、大红袍、祁门红茶茶多酚提取物中的总多酚含量进行了测定，结果表明，经半发酵工艺处理后的大红袍和全发酵工艺处理后的祁门红茶，其茶多酚提取物中的总多酚含量相较未发酵的黄山毛峰茶多酚提取物中的总多酚有不同程度的下降，且发酵程度越高，总多酚含量下降越多。推测可能与茶叶在发酵过程中，多酚类物质发生氧化、聚合生成茶黄素、茶红素等其他物质［20］，导致多酚含量下降有关。

本研究MTS试验结果表明，黄山毛峰、大红袍、祁门红茶的茶多酚提取物对HCT116细胞的增殖均有抑制效果。且在特定浓度范围内，3种茶叶茶多酚提取物对HCT116细胞作用的IC50值有显著差异，且发酵程度越高的茶叶提取物对HCT116细胞作用的IC50值越高，抑制效果越小。3种茶叶茶多酚对HCT116的抑制作用与茶多酚提取物中总多酚含量具有一定的量效关系。已有研究表明，绿茶在贮藏过程中茶多酚和黄酮含量的减少与抗氧化活性的降低趋势具有很好的对应关系［21］，这也与本研究结果一致。同时，本研究进一步证实了茶多酚是茶叶中主要抗癌活性成分［22］，且茶叶在不同发酵工艺过程中，引起了多酚氧化酶活性的改变，进而影响到茶多酚氧化聚合反应机制，促使茶叶内多酚类物质含量、组成成分、分子结构等的改变，从而产生不同的生理活性［23］。本研究中3种不同发酵程度茶叶茶多酚表现出的不同抑癌效果可能也与此有关。

通过细胞形态观察，在特定浓度条件下，黄山毛峰茶多酚提取物和大红袍茶多酚提取物作用HCT116细胞后，细胞生长状况发生明显改变，贴壁细胞皱缩、变圆，凋亡小体增多，折光性差。祁门红茶茶多酚提取物作用后，细胞也出现一定程度凋亡特征，但相较前两种茶多酚提取物形态改变程度小，这也进一步证实了MTS试验结果。