翅萼石斛组织培养及快繁技术研究

仇 硕，赵志国，赵 健，夏 科，熊亚兰，唐凤鸾

（广西植物功能物质研究与利用重点实验室/中国科学院广西植物研究所，广西 桂林 541006）

翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb.f.）是一种喜阴凉的多年生兰科石斛属（Dendrobium）草本植物，产自云南南部至西南部，生于海拔1 100～1 700 m的山地林中树干上。翅萼石斛具有较高的观赏价值，花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，具有橘子香气味［1］。近年也有研究报道了翅萼石斛的药用成分，郝普彦等［2］采用GC-MS联用技术对翅萼石斛的脂溶性成分进行了分析鉴定，共鉴定出34种化合物，主要为烷烃类和酯类；也有对翅萼石斛药材进行鉴别的研究［3-4］，说明其具有较高的药用价值。然而，翅萼石斛并没有被中国药典收载，而民间常作为石斛药用品种，特别是云南等西南地区广泛使用，加上生态环境的不断破坏，致使野生资源数量剧减。

石斛属是兰科第二大属，有1 500多个野生种和上万个栽培种，如铁皮石斛、金钗石斛等是名贵的药用类石斛［5-7］；而观赏类石斛兰（常分春石斛系列和秋石斛系列）则是全世界公认的四大洋兰之一［8］，因此，该属植物具有很高的药用价值或观赏价值。近10多年来，随着组培技术的发展以及生产需要，一些高经济价值植物常利用组培快繁种苗［9-11］，蝴蝶兰、文心兰等名贵兰花的规模化生产也通过组培快繁［12-15］。石斛属植物中，铁皮石斛、鼓槌石斛等已经实现规模化生产［16-18］，而翅萼石斛目前市场上销售货源主要靠野外采挖，破坏资源的同时也不能满足市场需求。相比传统分株繁殖技术，组培快繁技术具有繁殖速度快、繁殖系数高等优点，特别是通过无菌播种规模化快繁种苗更简单快捷，而且育苗成本更低［19-21］。翅萼石斛属于石斛属黑毛组（Dendrobium formosum）植物，可能因叶片和叶鞘被黑色毛而较难彻底消毒，目前没有利用茎尖或茎段进行成功诱导不定芽及无菌播种快繁研究的报道。鉴于此，本文以自交结实的翅萼石斛蒴果种子为材料，研究无菌播种及原球茎诱导、原球茎增殖及丛生芽诱导、生根壮苗以及移栽驯化等规模化快繁种苗的关键技术，旨在建立一套通过种子规模化生产翅萼石斛种苗的组培快繁技术体系，为其商业化推广奠定基础，也为其资源保护提供解决方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为翅萼石斛，2014年引自云南文山，种植于桂林市雁山区广西植物研究所内兰花种质资源圃，人工自交授粉，选用无病害、生长健壮的快要成熟但未开裂的蒴果作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 种子消毒及接种 将快要成熟但未开裂的翅萼石斛蒴果采回后，用洗洁精清洗蒴果表面，再用自来水冲洗30 min，置于超净工作台上，用75%（V/V）酒精浸泡1 min，无菌水冲洗1次，0.1%升汞（HgCl2）浸泡15 min，无菌水冲洗5次，备用。

1.2.2 种子萌发和原球茎诱导 将经过消毒的石斛种子切口，均匀撒播于备用培养基上，基本培养基选用MS+NAA 0.1 mg/L+琼脂5.0 g/L+蔗糖20 g/L，并添加不同浓度的6-BA（1.0、2.0、4.0 mg/L），此外还选择一个在6-BA 1.0 mg/L条件下加入1.0 g/L活性碳的配方，共4个处理，pH 5.8。每个处理播种20瓶，播种后置于组培室暗培养，待种子萌动变绿后转到光下培养。

1.2.3 原球茎增殖和丛生芽诱导 将萌发的原球茎转接到以下丛生芽诱导培养基中：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+活性碳1.0 g/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖20 g/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+马铃薯泥100 g/L+蔗糖20 g/L。每个处理接种30个原球茎，重复3次，pH 5.8，然后置于LED光源、光照时间12 h、光强1 500～2 000 Lx、温度25（±2）℃的条件下培养。

1.2.4 生根壮苗 当小苗长出2～3片叶子、高1～2 cm，便可转接到生根壮苗培养基中，培养基配方设1/2MS+NAA 0.8 mg/L+香蕉泥200 g/L+蔗糖30 g/L+活性碳1.0 g/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+香蕉泥100 g/L+活性碳1.0 g/L两个处理，pH 5.8，然后置于LED光源、光照时间12 h、光强1 500～2 000 Lx、温度25（±2）℃的条件下培养。每瓶接种15～20个丛生芽，每个处理接种30瓶以上，重复3次。培养90 d后，随机挑选无污染的10瓶，统计生根率，统计生根率、根长及株高等，取平均值。

1.2.5 移栽驯化 将生根试管苗分别于3～4月和6～7月移栽到室外炼苗，15～30 d后，洗净根部培养基，移栽到经多菌灵消毒处理的以下3种基质中：水苔∶树皮∶珍珠岩∶蛭石=10∶2∶1∶1（V/V）、树皮∶珍珠岩∶蛭石=1∶1∶1（V/V）、水苔。用底部带孔的塑料育苗盘（54 cm×28 cm）或塑料杯（9 cm×10 cm）种植，每个处理种植60株（丛）以上，3次重复。然后置于塑料大棚内，夏季用70%遮阳网遮阴，移栽2个月后统计试管苗成活率及生长情况。

2 结果与分析

2.1 翅萼石斛种子萌发及原球茎的诱导

播种后经过大约20 d的暗培养，翅萼石斛种子逐渐变绿，然后再过30 d左右膨大形成原球茎（图1，封三），观察统计种子在各种培养基中的萌发情况。结果发现，翅萼石斛种子在含有不同浓度6-BA的萌发培养基中均能萌发，但当6-BA浓度为2.0、4.0 mg/L时容易黄化，特别是4.0 mg/L处理黄化严重、不能正常生长，而在1.0 mg/L 6-BA处理培养基中能继续正常生长。此外，种子在同时含有1.0 mg/L 6-BA和1.0 g/L活性碳的培养基中未见萌发或仅少数萌发（图1）。

2.2 翅萼石斛原球茎增殖及丛生芽的诱导

翅萼石斛原球茎增殖情况统计见表1。表1显示，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+活性碳1.0 g/L培养基中原球茎增殖及丛生芽诱导增殖系数最高，接种45 d后可以达到5.8个，且生长情况良好（图2A，封三）。该配方与种子萌发及原球茎诱导的最佳培养基一致，仅多增加了活性碳，如果不更换培养基，原球茎持续生长增殖，也可以诱导出丛生芽，但是苗很弱（未统计增殖系数，图2D，封三）。翅萼石斛原球茎在含有香蕉泥和马铃薯泥的培养基中也具有较高的增殖系数，分别达到4.9和5.3个，生长情况也良好（图2B、图2C，封三）。可见，本研究选择的3个原球茎增殖及丛生芽的诱导培养基配方效果都比较好，添加活性碳、香蕉泥或马铃薯泥对其原球茎增殖和丛生芽诱导结果影响不大。

表1 翅萼石斛原球茎增殖及丛生芽诱导统计情况

2.3 翅萼石斛丛生芽的生根壮苗

选择生长健壮、苗长2～3 cm的翅萼石斛丛生芽接种到生根壮苗培养基中，3个月后观察统计。翅萼石斛丛生芽在1/2MS+NAA 0.8 mg/L+香蕉泥200 g/L+蔗糖30 g/L+活性碳1.0 g/L培养基上生根率约为33%（表2），植株生长较差，根系短，平均根长只有3.80（±0.52）cm，株高只有4.40（±0.56）cm（图3A，封三）。而在培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖30 g/L+活性碳1.0 g/L的培养基中生长则表现越来越好，组培苗叶片呈深绿色，100%生根，根系长8.90（±0.74）cm，株高平均9.30（±0.82） cm，苗健壮（图3B，封三）。

表2 翅萼石斛丛生芽的生根壮苗统计情况

2.4 翅萼石斛瓶苗室外移栽驯化

翅萼石斛生根后的瓶苗移栽后2个月统计成活率，结果（表3）显示，无论春季（3～4月）还是夏季（6～7月）的移栽，翅萼石斛在树皮∶水苔∶珍珠岩∶蛭石=10∶2∶1∶1和树皮∶珍珠岩∶蛭石=10∶1∶1的移栽基质中均不能成活，移栽2个月后均不成活；而用水苔做移栽基质，春季（3～4月）移栽成活率能达到76.7%、且长势良好（图4，封三），而夏季（6～7月）成活率只有15%、且后期长势较差。

表3 翅萼石斛瓶苗室外移栽驯化情况统计

3 结论与讨论

石斛属植物因具有较高的经济价值而被广泛关注，有关该属植物的组培快繁技术已有很多报道，特别是名贵药材铁皮石斛早已实现规模化生产［16，19］。为了应对市场需求，本研究通过“无菌播种及原球茎诱导-原球茎增殖及丛生芽诱导-丛生苗生根壮苗-移栽驯化”建立翅萼石斛规模化生产的快繁技术体系。结果发现，翅萼石斛种子萌发和原球茎诱导的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L，种子萌发质量随6-BA浓度的升高而降低，高浓度6-BA（4.0 mg/L）会引起原球茎的死亡，这与余乐研究报春石斛无菌萌发的结果［21］相似。增殖系数的高低是组培快繁的关键技术之一，本研究发现添加香蕉泥或马铃薯泥对其原球茎增殖和丛生芽诱导结果影响不大，综合认为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+活性碳1.0 g/L最佳，45 d增殖系数达5.8，生长情况良好。本文筛选的培养基MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖30 g/L+活性碳1.0 g/L更适合翅萼石斛丛生苗的生根壮苗培养，生根率100%，根系长，组培苗健壮，叶片深绿色。

移栽驯化也是组培快繁技术是否成功的关键技术之一，前人对石斛属植物组培生根苗的驯化大都利用水苔做基质或者含有较高比例的水苔［22-24］。结合翅萼石斛的生长特性及前期引种驯化情况，本文选择含少量水苔的移栽基质（树皮∶水苔∶珍珠岩∶蛭石=10∶2∶1∶1）以及不含水苔的移栽基质（树皮∶珍珠岩∶蛭石=10∶1∶1）进行移栽，生长60 d后成活率均为0；而用水苔做基质，3～4月份移栽成活率76.7%，表现良好，导致移栽成活率较低的原因可能与翅萼石斛不适应桂林气候有关。

图1 翅萼石斛无菌播种培养

图2 翅萼石斛原球茎增殖及丛生芽的诱导

图3 翅萼石斛丛生芽的生根壮苗

图4 翅萼石斛在移栽基质水苔中的长势