阴虚上火血清蛋白潜在标志物的鉴定评估

尉理梁易文晶刘昌铭江婷婷鲁任屠慧慧甘霖胡玉婷李志斌黄淮施力颖李仲杰李继承陈静

1.绍兴市立医院 浙江，绍兴 312000 2.浙江大学 3.华南理工大学 4.中国人民解放军第一一七医院5.浙江医院

阴虚上火是各种因素引起的一种亚健康状态[1]，在人群中十分常见，以头面部黏膜损伤为主要特征，常见表现为两颧潮红、口内疼痛、口干欲饮、手足心热、大便干燥、舌红少苔、脉弦细数，愈后常易复发。阴虚上火具有自限性，但常合并其他病症存在，例如糖尿病[2]、肺结核[3]、肝癌[4]、过敏性紫癜[5]等。随着现代生活节奏加快，阴虚上火的发生率日益升高，尤其是学业或工作压力大的学生、白领人群，其发生率逐渐上升，严重影响日常生活质量。

传统中医认为，机体由于津液不足，濡润、宁静功能减弱，致使阴阳不平衡，阳气相对过盛而发展为阴虚上火。心火旺盛则夜不能寐、口舌溃烂；肺火炽盛则干咳无痰、气短无力；肝火过亢则胁闷不舒、头晕心烦[6-7]。而现代医学认为阴虚上火是机体代偿范围内产生的应激反应[8]，其生物学机制尚不明确。目前，阴虚上火的诊断主要通过望、闻、问、切的方式判别，依赖于中医医师的主观经验，缺乏量化统一的诊断标准。因此，亟需运用现代生物学手段，进行阴虚上火生物学本质探讨，寻找阴虚上火的新型诊断标志物，为揭示阴虚上火的生物学机制奠定基础，并建立规范化量化的诊断指标，深化对阴虚上火的认识。

实验室前期以大鼠模型模拟人体阴虚上火状态，研究发现阴虚上火与能量代谢、免疫反应密切相关[9-12]。前期研究显示阴虚大鼠免疫功能紊乱，尤其是激肽原-1(Kininogen-1，KNG-1)的表达水平显著升高[12]，但尚未在人群中验证。载脂蛋白A2(apolipoprotein A2，APOA2)和载脂蛋白B(apolipoprotein B-100，APOB)是参与胆固醇代谢的重要蛋白。Han等[13]的研究结果显示阴虚上火大鼠异常表达基因促进胆固醇合成和代谢，增加能量消耗，降低防御反应。CD14是单核细胞分化抗原，与炎症反应和机体免疫反应有关。因此，本研究假设 KNG-1、CD14、APOB、APOA2 可能与人体阴虚上火的发生有关，对其血清浓度进行检测，并评估其作为阴虚上火诊断标志物的临床价值。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 KNG-1 ELISA检测试剂盒购于台湾 Abnova公司（批号：KA1040）；APOB ELISA 检测试剂盒和APOA2 ELISA检测试剂盒购于英国Abcam 公司（批号：ab108807、ab108805）；CD14 ELISA检测试剂盒购于美国Raybiotech公司（批号：ELHCD14-1）。高速离心机购于日本Hitachi公司；全波长酶标仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 样本收集 本研究经过浙江大学伦理委员会批准，所有受试者均知情同意。于2015年6月至2016年12月共采集34例受试者血清样本，其中17例阴虚上火组患者来自杭州市萧山区中医院，17例健康对照为平和体质人群，来自解放军第117医院。阴虚上火的诊断依据2017年发布的中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》中口疮的中医疾病诊断标准和证候分类诊断标准[14]。纳入受试者年龄18～65周岁，均排除合并各系统严重器质性病变、精神病、肿瘤、结核等疾病，并排除怀孕、哺乳期妇女。晨起空腹状态下，采用一次性真空不抗凝采血管采集受试者全血，于4℃、3 000r/min离心10min，吸取上清液分装保存于-80℃冰箱。

1.2.2 血常规和生化检测 收集受试者血液标本，常规进行血常规和生化检测。

1.2.3 ELISA 检测血清 CD14、APOB、KNG-1蛋白的表达 分别使用ELISA检测试剂盒检测人血清CD14、APOB、KNG-1、APOA2表达。根据试剂盒说明书进行ELISA实验，其中CD14稀释5 000倍，APOB稀释20 000倍，KNG-1稀释200倍，APOA2稀释1 000倍。运用酶标仪在450nm波长检测各组血清蛋白表达水平。

1.3 统计学分析 运用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。两组之间的性别比较运用χ2检验。若两组样本符合正态分布和方差齐性，以±s表示，运用t检验进行比较；若不符合，运用Mann Whitney U检验进行非参数检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。运用GraphPad Prism 5.01软件绘制散点图，再运用MedCalc 11.4.2软件绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线。

2 结果

2.1 两组受试者临床资料比较 对两组受试者的临床资料进行了统计分析，阴虚上火组平均年龄为（39.69±15.38）岁，其中男 7例，女 10例；健康对照组的平均年龄为（40.71±9.82）岁，其中男6例，女 11例，两组之间性别和年龄分布无统计学差异（P=0.814、P=0.821）。临床资料分析结果显示，阴虚上火组谷草转氨酶（P=0.024）、白蛋白（P=0.023）、高密度脂蛋白（P=0.048）、总胆固醇（P=0.001）、尿素氮/肌酐（P＜0.001）、红细胞压积（P=0.007）、红细胞分布宽度含量（P=0.009）显著低于健康对照组，阴虚上火组平均红细胞血红蛋白浓度（P＜0.001）、单核细胞绝对值（P=0.024）、单核细胞百分比（P=0.003）显著高于健康对照组。见表1。

表1 两组受试者临床资料比较Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups of subjects

2.2 两组受试者血清 CD14、APOB、APOA2、KNG-1蛋白的表达比较 对阴虚上火组与健康对照组受试者的血清 CD14（Swissprot：P08571）、KNG-1（Swissprot：P01042）、APOB（Swissprot：P04114）、APOA（Swissprot：P02652）蛋白的浓度进行了检测。实验结果显示，与健康对照组比较，阴虚上火组血清CD14、KNG-1显著上调（P＜0.001，P＜0.05），APOB、APOA2 显著下调（P＜0.05，P＜0.01），具有统计学意义。见图 1。

图1 两组受试者血清蛋白表达水平Fig.1 Serum protein expression levels in two groups

2.3 ROC分析 为了研究单个蛋白诊断阴虚上火的效果，本研究绘制了ROC曲线评价每个蛋白的敏感度和特异度，实验结果显示CD14的曲线下面积（area under curve,AUC）值为 0.841，敏感度为 64.70%，特异度为100%；APOA2的AUC值为0.794，敏感度为78.60%，特异度76.50%；APOB的AUC值为0.732，敏感度为94.10%，特异度为54.80%；KNG-1的AUC值为0.725，敏感度为70.60%，特异度为82.40%。实验结果显示，APOB蛋白的特异度较低，不适合作为诊断标志物，故舍弃。进一步将CD14、APOA2、KNG-1进行组合，构建蛋白质诊断模型，其AUC值为0.934，敏感度和特异度分别达到100%、71.40%，具有较好的准确性。见图2。

图2 APOA2、CD14、KNG-1蛋白及其组合物的ROC曲线图Fig.2 ROC curve of APOA2,CD14,KNG-1 protein and their combination

3 讨论

阴虚上火是普遍的亚健康状态，其循环往复的症状，严重影响人们的日常生活质量。目前，针对阴虚上火症状，临床上多运用中医手段进行治疗。但中医治疗的前提是辨证，中医对“证”的辨别缺乏定量、客观的标准。阴虚上火产生的生物学机制尚不明确，其临床诊断受制于传统中医的个人经验，缺乏客观统一的量化诊断指标，因而存在诸多争议。本研究进行了阴虚上火人群、平和质人群的临床资料分析，对受试者血清特异蛋白浓度的进行了检测，并对特异性蛋白质及其组合物的诊断效果进行了评估。

阴虚上火组的临床检测指标仍在正常范围内，但与健康对照组相比，具有显著差异。阴虚上火组的谷草转氨酶、白蛋白、尿素氮/肌酐比值、高密度脂蛋白、总胆固醇含量显著下调，提示阴虚上火患者能量消耗和代谢增强，说明“阴虚生内热”的中医理论具有一定的物质基础。于赫等[15]研究发现，肾阴虚患者体内能量代谢增强，有氧氧化增强，与本实验结果相符，表明阴虚可能引起能量消耗、代谢增强。并且，阴虚上火组红细胞压积下调、平均红细胞血红蛋白浓度上调、红细胞分布宽度下调，提示阴虚上火患者发生氧化应激，这可能与有氧代谢活动的增强有关。统计结果还显示，阴虚上火患者单核细胞绝对值与单核细胞百分比显著上调，说明阴虚上火与炎症反应密切相关。

本研究进一步对代谢、炎症相关蛋白表达进行了检测，发现阴虚上火患者CD14与KNG-1显著上调，APOB与APOA2显著下调，具有统计学意义。KNG-1为激肽原1，是一种炎症介质，能引起血管通透性增加，并具有抑制凝血酶与纤溶酶聚集的功能[16]。已有研究报道，人阴虚上火后肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）表达水平显著增加[17]。激肽原可以裂解产生血管舒缓激肽与高分子量激肽原，而高分子量激肽原能够促进单核细胞释放TNF-α、IL-1β等细胞因子与趋化因子[18]。CD14是单核细胞分化抗原，Toll样受体（tolllike receptor，TLR）的辅受体，参与炎症反应和机体的固有免疫反应。已有报道指出，TNF-α可以上调CD14的表达[19]，而CD14可以介导负电性低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）促进细胞因子释放的作用[20]。因此，KNG-1、CD14是与阴虚上火免疫紊乱相关的重要蛋白，二者的上调说明了阴虚上火患者炎症反应增强。

APOB与APOA2为载脂蛋白。APOB具有介导乳糜微粒、LDL、极低密度脂蛋白运输的作用，与血脂水平相关[21-22]。APOB是低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的主要结构蛋白，检测其表达水平能够反映LDL-C的含量变化。已有研究报道健康人体内内源性胆固醇的合成与极低密度脂蛋白-APOB-100亚组分的产生有关[23]；抑制APOB合成，能够引起脂蛋白中的APOB含量降低[24]。因此，APOB的下调说明LDL-C的含量降低，可能影响总胆固醇水平和脂蛋白水平变化。

APOA2为高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）组分[25]，具有稳定高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、参与 HDL代谢的功能，其表达水平下调可能直接或间接影响总胆固醇水平[26]。本研究显示，阴虚上火组受试者总胆固醇水平显著下降，提示阴虚上火人群营养状况改变。潘照等[27]的研究结果显示，肠道菌群可引起“上火”人群普遍体内能量代谢紊乱，进一步印证了本实验的结果。课题组前期研究同样印证了这一点，阴虚上火大鼠模型的能量代谢增加，体型消瘦[28]。鉴于此，笔者认为阴虚上火与机体免疫失调、能量代谢失衡有关，推测这4个蛋白与阴虚上火的发生发展密切相关，可作为诊断阴虚上火的潜在生物学标志物。

在此基础上，运用ROC曲线分析了单个蛋白的敏感度和特异度，发现APOB的特异度低于60.00%，不适于作为潜在的生物学标志物。再将APOA2、KNG-1、CD14进行组合，结果提示其AUC值高于0.900，具有较高的准确性，优于单个蛋白质的准确性，且具有较好的敏感度和特异度。

综上，本研究认为阴虚上火与机体免疫失调、能量代谢失衡有关，阴虚上火人群血清4个特异蛋白（APOB、APOA2、KNG-1、CD14）出现差异表达，为中医诊断阴虚上火提供了潜在的生物学诊断标志物，为揭示阴虚上火的生物学机制提供了实验依据，有助于从客观上认识与理解阴虚上火。