基于液相色谱-质谱联用的血清代谢组学在中医上火研究中的应用

吴德鸿周佳李倩倩谭祖教范永升

1.浙江中医药大学附属第二医院 杭州 310005 2.浙江中医药大学基础医学院

“上火”的概念源于中医学对人体和疾病的认识，但中医学中尚无专门论述，其内容散见于中医火热病证中。上火的基本病机为阴阳失衡，火热上炎于头面，其临床表现主要以口舌生疮、口腔溃疡、牙龈及咽喉肿痛、眼睛红肿等头面部症状为主，也常兼见心烦易怒、小便色黄、大便秘结等热证表现，属中医学“火热”证的范畴。

现代医学至今还未有与上火相对应的病名，一般认为上火与机体免疫功能失调情况下出现的局部感染或炎症反应相类似，同时认为上火是机体受到外界应激负荷后在生理和心理上产生的一种不协调的应激反应，是机体失去内环境稳定而出现的身心疲劳状态，其发生可能与机体的神经-内分泌-免疫网络失衡相关。随着亚健康观念的提出以及人们对健康追求的逐步重视，在祖国医学对上火认识的基础上，运用现代的科学技术方法，开展上火的病理机制研究，不仅能够丰富其内涵，同时对于上火的防治也有着重要的现实意义。

代谢组学以病理生理等刺激下机体内源性代谢物发生的相应变化为研究对象，可以从整体上反映机体在疾病发生发展过程的代谢状态改变，有助于阐明病变过程，为疾病预防、诊断提供有用信息。目前代谢组学被广泛用于疾病诊断、药物安全性评价、发病机制探讨、药物作用机制研究等医药相关领域[1-3]。液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技术具有分离能力强、检测灵敏度高、分析通量高、检测范围广等优点，在代谢组学研究中应用非常广泛。

本研究以在校学生及教师为研究对象，采用LCMS技术对上火和非上火人群血清中代谢物进行检测，并结合多变量和单变量统计挖掘出上火后发生显著变化的血清代谢物，进一步进行结构鉴定，以期从代谢角度为上火机制的深入研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器 LC 1260/Q-TOF 6520液相色谱-质谱联用仪为美国Agilent公司产品；Labconco CentriVap System冷冻离心浓缩仪为美国Labconco公司产品；超纯水由Milli-Q系统（美国Millipore公司产品）制备。

1.2 试剂 色谱纯乙腈购于Sigma公司（批号：SHBB8059V）。

1.3 实验方法

1.3.1 上火的诊断标准 采用专家咨询法，通过多轮专家咨询，确定了上火的诊断标准：1个主证（头面部症状）或2个次证（至少1个为头面部症状）。其中上火头面部主证：牙龈肿痛、咽喉肿痛、口臭、口腔溃疡、鼻疮疖、热疮（颜面部疱疹）、口苦、目赤干涩；上火头面部次证：口角糜烂、目眵增多、舌痛、口渴、鼻衄、鼻腔干燥、齿衄、痤疮、声音嘶哑、头痛；非头面部症状：大便干结、心烦、小便黄、多食易饥、五心烦热、痔疮发作、潮热、失眠。

1.3.2 样本的收集和前处理 选取2013年3月至5月浙江中医药大学在校学生及教师54例，年龄22～3 6岁，无重大疾病，排除妊娠、哺乳期妇女和其他不适宜入选的情况。其中符合纳入标准的上火病例30例，年龄（22.0±1.3）岁；作为对照组的非上火人群24例，年龄（23.1±3.1）岁。两组受试者年龄无统计学差异（P＞0.05）。受试者填写调查表，空腹状态下以促凝管采集血5mL，2 000r/min离心分离血清，-80℃保存。

分析前，血清于室温下解冻并混匀，取100μL血清，加入4倍体积冷乙腈，涡旋后4℃下12 000r/min离心10min沉淀蛋白，取上清液用于分析。同时，所有血清样本分别取20μL，混匀后按照上述方法进行相同前处理，制备质量控制（quality control，QC）样本。

1.3.3 代谢数据采集 以LC-MS作为分离检测平台，研究上火人群的血清代谢特征，在质谱正离子模式下采集数据。色谱条件为：ZORBAX SB-Aq C18柱（2.1mm×50mm×1.8μm，Agilent）用于色谱分析，进样量5μL，柱温保持在30℃。流动相A为0.1%甲酸/水，流动相B为0.1%甲酸/乙腈。流速为0.3mL/min，洗脱梯度为：20%B 起始，0～8min 线性升至 50%B，8～12min线性升至 55%B，12～18min线性升至 75%B，18～20min线性升至98%B，在98%B保持2min，然后降至20%B并保持6min以平衡色谱柱。

质谱条件为：电喷雾离子源（electrospray ion source，ESI），采用正离子模式检测，使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，干燥气温度350℃，流速为9L/min，雾化气压40psi；离子源温度350℃，毛细管电压为4 000V，溶剂化离子去簇电压175V，锥孔电压65V，Centroid模式采集质谱数据，每0.50s采集1次；质量扫描范围m/z 50～1 000。分析过程中采用参比溶液对质量轴进行同步实时校正。靶标二级质谱分析用来辅助鉴定代谢物，碰撞能量为10、20、40eV。

1.3.4 数据分析 通过安捷伦MassHunter定性分析软件（美国Agilent公司产品）进行分子特征提取（molecuar features extraction algorithm，MFE），实现对谱图中代谢特征的识别，包括滤噪和同位素峰合并。提取参数：保留时间为 0.6～22min，质荷比为 50～1 000m/z，信号阈值为100counts，化合物阈值为2 000counts。将MFE后生成的CEF文件导入到Mass Profiler Professional软件（美国Agilent公司产品）进行色谱与质谱匹配。色谱匹配时使用默认设置，质谱匹配窗口值为20mDa+50ppm。匹配完成后形成包含保留时间、质量数、响应值信息的峰表。QC样本中相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）大于30%的变量被删除，以保证数据的可靠性，另外，对于超过30%样品中响应值为“0”的离子采取过滤处理以减小缺失值的影响。

多元统计分析在SIMCA-P 11.0软件（瑞典Umetrics Corp公司产品）中完成。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交信号校正-偏最小二乘判别分析（orthogonal signal correction-partial least squares discriminant analysis，OSC-PLS DA）对上火和非上火血清样本进行分型，筛选变量重要性因子（variable importance in the projection，VIP）＞1 的变量进行后续的t检验，t检验在SPSS 16.0统计软件中完成。VIP＞1且在两组内有统计学差异的变量（P＜0.05）对两组样品的区分起了重要作用，之后对这些差异代谢物进行靶标二级质谱分析以鉴定其结构。

2 结果

2.1 分析方法考察 仪器分析过程中将QC样本均匀地插入分析序列中用于监控整个样品分析过程中的仪器状态波动情况，以确保数据的可靠性，每分析10个样本插入1个QC，样品分析顺序完全随机以减少系统误差。图1为典型的LC-MS代谢指纹谱。

图1 典型的血清HPLC-MS代谢指纹谱Fig.1 Representative serum metabolic profile analyzed by LC-MS

在7个QC样本中代谢物响应值的RSD分布趋势见图2A。在所有QC样本中超过78.01%的变量响应值RSD＜30%。删除QC中RSD＞30%的变量，同时排除样品中出现频率＜70%的变量，最终保留了521个变量的信息，对代谢数据进行单位方差标度化转换，即每个变量除以该变量方差的平方根，从而在一定程度上消除了响应差异的影响又不至于放大系统偏差。在PCA分析中，QC样本紧密地聚集在PCA得分图的几何中心附近，表明分析过程中代谢物分析的质量控制良好,得到的代谢数据可靠。见图2B。

2.2 上火与非上火人群的模式识别分析 采用非监督的PCA对两组样本的整体代谢轮廓进行分析，上火和非上火人群在PCA二维得分图上无明显分离（图2B），这可能与饮食和环境等因素造成的样本不均一性有关；为了更好地建立模型及提高模型预测能力，进一步对数据进行正交信号校正（orthogonal signal correction，OSC），滤除与分类无关的信息（饮食、环境等影响）之后进行PLS DA建模。图3A显示两组人群得到了很好的分离，表明上火后代谢表型出现一定的变化。模型参数良好，R2Y（cum）=0.992，Q2（cum）=0.960。图3B是OSC-PLS DA 第一主成分V图。以代谢物在上火人群与非上火人群的浓度比值取log2对数为横坐标，t检验P值取-log10对数为纵坐标，绘制代谢物火山图。火山图显示LC-MS检测到的血清代谢物中，上火后55个发生显著变化，且大部分浓度发生下调。见图3C。

图2 代谢物RSD分布情况和PCA分析得分图Fig.2 The RSD distribution plot of QC samples and PCA score plot

图3 上火与非上火人群的代谢差异分析Fig.3 Metabolic difference between Shanghuo patient and control groups

2.3 上火人群血清差异代谢物 结合火山图和VIP值筛选出上火与非上火人群存在显著差异的代谢物，部分差异代谢物结构已经确认，主要是脂类物质，包括2种磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、2种溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）、1 种磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、1种溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）、2种鞘脂（sphingolipid，SM）、1种甘油三酯（triglyceride，TAG）及胆红素（bilirubin）等，上述代谢物在上火后下调明显（P＜0.05）。见图 4。

3 讨论

上火是民间的一种俗称，概念形成于祖国医学对其症状和病因病机的朴素认识。中医学著述中未对上火进行专门论述，但其症状表现与中医学中的“牙宣”“口疮”“唇风”“目赤”等相类似。上火发病部位多位于人体的头面之上，因此，从发病部位而言，上火具有“在上之火”的含义，符合“火热上炎”的特性，其是由多种原因引起阴阳失调、火热偏盛而导致的一系列以头面部为主的症状，其临床表现主要为口舌生疮、口腔溃疡、口眼干燥、牙龈及咽喉肿痛、眼睛红肿、痤疮等，同时也常兼见心烦易怒、小便色黄、大便秘结等火热证表现。现代医学对上火的研究较少，认为上火与多种因素引起的神经-内分泌-免疫网络失衡以及能量代谢相关联，但也有少量的实验研究成果，如陈娟等[4]发现实热上火人群体内多种蛋白表达发生异常，如载脂蛋白C3、乳酸脱氢酶等上调，载脂蛋白A4、超氧化物歧化酶3、纤溶酶原激活物抑制剂1等下调。笔者前期研究也发现，实热上火人群体内三羧酸循环、脂肪酸代谢、氨基酸代谢发生特异性变化[5]。

代谢组学运用现代化的仪器设备和分析技术检测机体整个代谢产物谱的变化，并通过多元统计分析方法研究整体的生物学功能状况，与中医的整体观相吻合。基于LC-MS技术的代谢组学平台分析范围广、灵敏度高，因而可全面地表征上火人群血清代谢组的特异性变化，为进一步探索上火的发病机制提供参考依据。本研究采用LC-MS技术检测上火人群和非上火人群的血清代谢物后发现，上火人群与非上火人群的代谢谱存在显著差异，部分差异代谢物结构已经确认，主要是脂类物质，如 PC（34:1）、PC（38:7）、LPC（18:1）、LPC（16:0）、LPE（18:2）、PE（34:2）、SM（44:2）、SM（40:2）、TAG（53:3）及胆红素等，以上代谢物在上火人群中明显低于非上火人群。

从上述结果可见，上火人群血清异常代谢物主要是脂类物质和胆红素等。有文献报道脂与类脂成分改变可作为细胞老化的标志，脂质过氧化对细胞有损害作用并与细胞老化有关[6]。活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）是造成衰老的主要因素，细胞膜上含不饱和脂肪酸侧链的磷脂是天然的抗氧化物质，可与ROS反应，使之被清除，而反应生成的过氧化脂质会破坏细胞膜的结构和功能。研究证实，许多衰老有关的疾病如动脉硬化症、高血压、阿尔兹海默症以及帕金森病等的发生发展与脂质的异常变化有关[7-9]。本研究发现上火人群体内多种含不饱和脂肪酸链的磷脂水平明显下降，这可能与上火后氧化应激水平的升高有关。林富祥等[10]采用大学生“上火”调查问卷的形式对1 051名在校大学生进行流行病学问卷调查，结果发现经常熬夜、压力过大以及辛辣食物是引发上火的主要原因，而这些因素也是加速人体衰老的原因，可见上火与衰老是有相关性的。摒弃不良的生活习惯、缓解工作和生活压力不仅可以预防上火，还可减缓人体的衰老。

图4 差异代谢物在上火和非上火人群中的变化Fig.4 Significant differential metabolites between Shanghuo patient and control group

血清胆红素是血红素代谢的终产物，以往仅用于临床肝胆疾病的诊断。自1987年发现胆红素有抗氧化作用以来，有关胆红素的研究越来越受到关注。研究发现胆红素是生理性的抗氧化剂，它不仅能抑制脂质氧化及ROS的形成，还能抑制免疫反应及炎症反应[11-12]。因此，笔者推测上火主要表现为口腔溃疡、口疮等一些头面部的炎症反应，这与胆红素的含量减少不能有效抑制免疫反应及炎症反应相关。

上火的发生是一个复杂过程，涉及到免疫、内分泌、神经、代谢等多个系统，本研究运用代谢组学中的LC-MS技术从整体上检测上火人群血清代谢物的变化，发现血清中多种脂类物质和胆红素水平均有一定程度下调，可能与上火人群体内炎症反应加强、氧化应激水平升高有关。下一步将运用这些最下游的血清代谢物来回溯其上游相关信号通路中蛋白、基因的表达，以更好地阐述上火的病理机制，这也是笔者运用代谢组学研究上火的重要目标。