沉默结肠癌转移相关基因KPNA2对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭和顺铂敏感性的影响及其机制

李倩，高洁凡，齐冰丽

(沧州市中心医院，河北沧州061000)

卵巢癌是女性恶性肿瘤中预后最差的一种，因缺乏高效的筛查方法，确诊时多处于进展期[1，2]。随着近年来腹腔镜手术的发展成熟，以及吉西他滨等二线化疗药物的研发上市，给卵巢癌患者带来了更多希望，但并未有效延长其总生存期，这主要与患者对铂类基础化疗药物的耐药有关[3～5]。结肠癌相关基因KPNA2是近年来发现的与结肠癌发展、转移密切相关的标志物[6，7]。随着研究深入，发现KPNA2在肝癌、肺炎、卵巢癌等多种恶性肿瘤组织中均可检出[8～10]，但目前尚无KPNA2与卵巢癌铂类耐药相关的研究报道。2016年3月1日～2018年5月3日，我们观察了沉默KPNA2对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭和顺铂敏感性的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂 人卵巢癌细胞系CAOV3购于上海匹拓生物科技有限公司。Erk通路抑制剂U0126d、靶向KPNA2基因的pSUPER-Egfp-s3重组质粒以及空质粒pSUPER-Egfp-neo购于上海北诺生物科技有限公司；兔抗人KPNA2单克隆抗体、兔抗人Erk1/2和p-Erk1/2多克隆抗体、兔抗人Caspase-3、活化后Caspase-3单克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；ECL显色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、Transwell小室购于北京科宇深蓝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组与转染 CAOV3细胞放入含10%胎牛血清的DMEM培养液中，CO2孵箱中常规培养。取对数生长期CAOV3细胞，按1×106/mL密度接种于24孔板，继续培养24 h。细胞60%～80%融合后，分为重组质粒转染组(pSUPER-Egfp-s3转染CAOV3细胞)、空质粒转染组(pSUPER-Egfp-neo转染CAOV3细胞)、空白对照组(未转染)、U0126d组(CAOV3细胞+30 μmol/L 的U0126d)、重组质粒转染+U0126d组(pSUPER-Egfp-s3转染CAOV3细胞+30 μmol/L的U0126d)。转染48 h后进行后续实验，G418筛选细胞克隆集落。

1.2.2 各组CAOV3细胞KPNA2 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR。收集转染48 h后的重组质粒转染组、空质粒转染组、空白对照组CAOV3细胞，TRIzol提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA。KPNA2基因上游引物5′-GGAAGCACCATTACGAAGG-3′，下游引物5′-TCCCGAAGGTAACATAACTA-3′，引物合成由南京信帆生物技术有限公司合成。实时荧光定量PCR常规反应条件下共进行40个循环，94 ℃延伸4 min，以GAPDH为内参，计算KPNA2 mRNA的表达量(用2-△△Ct表示)。

1.2.3 各组CAOV3细胞培养液KPNA2、Erk1/2、p-Erk1/2、Caspase-3、活化后Caspase-3蛋白检测 采用Western blotting。分别将重组质粒转染组、空质粒转染组、空白对照组、U0126d组及重组质粒转染+U0126d组的CAOV3细胞均匀接种到6孔板，培养至40%～50%融合后，用蛋白测定试剂盒检测培养液上清中的受检蛋白，以β-actin为内参，结果用灰度值表示。

1.2.4 各组CAOV3细胞生长抑制及顺铂敏感性观察 采用MTT法。 取对数期重组质粒转染组、空质粒转染组、空白对照组、U0126d组及重组质粒转染+U0126d组的CAOV3细胞细胞，胰酶消化后配置单细胞悬液，按1×106/孔密度接种到96孔板，CO2孵箱中培养24 h，分别加入终浓度为0、5、10、20、40、80 μmol/L的顺铂，每个浓度设置3个复孔。培养2 h后更换为完全培养基，继续培养72 h后每孔滴加10 g/L的MTT 10 μL，培养4 h，弃去培养基，每孔加100 μL二甲基亚砜，振荡5 min，读取酶标仪450 nm波长处的吸光度值，计算CAOV3细胞生长抑制率及顺铂对CAOV3细胞的半数抑制浓度(IC50)。

1.2.5 加入顺铂后各组CAOV3细胞凋亡观察 采用流式细胞术。将对数期重组质粒转染组、空质粒转染组、空白对照组、U0126d组及重组质粒转染+U0126d组的CAOV3细胞各分为两份：一份按1×106/孔的密度接种到6孔板，细胞贴壁后加入顺铂溶液(浓度为“1.2.4”中空白对照组的IC50浓度)；另一份不加顺铂。常规培养24 h，取上层悬浮细胞，用PBS溶液配成1×105/孔的单细胞悬液，取 5 mL放入流式管中，滴加FITC和PI，避光放置30 min，流式细胞仪检测凋亡细胞。

1.2.6 各组CAOV3细胞迁移能力观察 采用Transwell法。取对数期重组质粒转染组、空质粒转染组、空白对照组、U0126d组及重组质粒转染+U0126d组的CAOV3细胞，调整密度为1×105/mL，向Transwell上室中滴加300 μL细胞液，下室中滴加600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液。常规培养24 h，取出小室，固定、染色、封固。在膜的中间和周边分别随机选取3个视野，光学显微镜下计数迁移细胞。

2 结果

2.1 重组质粒转染组、空质粒转染组、空白对照组CAOV3细胞KPNA2 mRNA、蛋白表达量比较 重组质粒转染组、空质粒转染组、空白对照组CAOV3细胞的KPNA2 mRNA相对表达量分别为0.09±0.01、0.49±0.03、0.52±0.06，重组质粒转染组与空质粒转染组和空白对照组相比，P均<0.01。重组质粒转染组、空质粒转染组、空白对照组CAOV3细胞的KPNA2蛋白相对表达量分别为0.18±0.03、0.44±0.05、0.45±0.05，重组质粒转染组与空质粒转染组和空白对照组相比，P均<0.01。

2.2 各组细胞Erk1/2、p-Erk1/2、Caspase-3、活化后Caspase-3蛋白表达比较 重组质粒转染组与空白对照组和空质粒转染组相比，Erk1/2蛋白表达量无明显差异(P均>0.05)，p-Erk1/2、Caspase-3蛋白表达量降低(P均<0.05)，活化后Caspase-3蛋白表达升高(P均<0.05)；与空白对照组和空质粒转染组相比，重组质粒转染+U0126d组的p-Erk1/2、Caspase-3、活化后Caspase-3蛋白表达改变更为明显(P均<0.01)；详见表1。

表1 各组CAOV3细胞Erk1/2、p-Erk1/2、Caspase-3、活化后Caspase-3蛋白灰度值比较

2.3 各组CAOV3细胞生长抑制及顺铂敏感性比较 加入5、10、20、40、80 μmol/L顺铂后，重组质粒转染组CAOV3细胞生长抑制率分别为0.23%±0.05%、0.42%±0.08%、0.50%±0.06%、0.61%±0.10%、0.70%±0.13%，空白对照组分别为0.12%±0.02%、0.25%±0.06%、0.33%±0.04%、0.36%±0.08%、0.45%±0.06%，空质粒转染组分别为0.15%±0.07%、0.28%±0.05%、0.35%±0.11%、0.42%±0.11%、0.49%±0.08%，重组质粒转染组与空白对照组、空质粒转染组相比，P均<0.01。顺铂对空白对照组、空质粒转染组、重组质粒转染组、U0126d组、重组质粒转染+U0126d组CAOV3细胞的IC50值分别为(46.41±0.52)、(46.19±0.56)、(27.12±0.86)、(38.85±0.91)、(19.95±0.73)μmol/L；重组质粒转染组顺铂的IC50与空白对照组和空质粒转染组相比，P均<0.01;重组质粒转染+U0126d组顺铂的IC50与重组质粒转染组相比，P<0.01。

2.4 加入及未加顺铂的各组CAOV3细胞凋亡率比较 未加顺铂时，空白对照组、空质粒转染组、重组质粒转染组、U0126d组、重组质粒转染+U0126d组CAOV3细胞凋亡率分别为0.51%±0.27%、0.77%±0.25%、1.43%±0.12%、2.94%±0.37%、3.85%±0.56%，组间相比，P<0.01。加入顺铂后，空白对照组、空质粒转染组、重组质粒转染组、U0126d组、重组质粒转染+U0126d组CAOV3细胞凋亡率分别为17.73%±2.35%、19.64%±2.51%、37.61%±1.84%、39.73%±2.38%、49.68%±1.50%；重组质粒转染组、U0126d组、重组质粒转染+U0126d组与空质粒转染组和空白对照组相比，P均<0.05；重组质粒转染+U0126d组与重组质粒转染组相比，P<0.05。

2.5 各组CAOV3细胞迁移能力比较 空白对照组、空质粒转染组、重组质粒转染组、 U0126d组、重组质粒转染+U0126d组穿过滤膜孔细胞数分别为(59.87±5.26)、(63.19±5.57)、(28.57±4.83)、(37.86±4.07)、(25.98±4.53)个;重组质粒转染组、U0126d组、重组质粒转染+U0126d组穿过滤膜孔细胞数与空白对照组、空质粒转染组相比，P均<0.05。

3 讨论

近年来以铂类化合物为基础的化疗在卵巢癌的临床治疗中取得了一定成效，然而肿瘤细胞易产生耐药性，从而导致化疗失败，患者5年生存率低至30%[11，12]。本研究的结果显示，沉默KPNA2基因后，顺铂对CAOV3细胞的抑制率明显上升、IC50值明显降低、细胞凋亡率明显增加、细胞迁移率明显降低。以上结果说明沉默KPNA2基因能够提高CAOV3细胞对顺铂化疗的敏感性，从而有效抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡。

Erk属于Mark家族，可通过磷酸化激活多种转录因子，调控细胞增殖、分化、凋亡等生物学行为[13]。研究[14]显示结肠癌细胞转染KPNA2后，HGF介导的癌细胞转移可被Erk通路抑制剂U0126d抑制，提示KPNA2高表达可激活Erk信号通路。沉默胰腺癌细胞中KPNA2基因表达后，观察到胰腺癌细胞活性明显降低，对盐酸吉西他滨的化疗敏感性增加，且Erk通路明显抑制，其下游Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2表达水平降低[15]。以上结果提示Erk通路及其下游信号因子可调控KPNA2对卵巢癌细胞功能和顺铂敏感性的影响。本研究的结果显示，沉默KPNA2基因后，p-Erk1/2蛋白表达明显降低，其下游Caspase-3蛋白表达也明显降低，说明沉默KPNA2基因可有效抑制Erk信号通路活性。进一步的研究结果显示，U0126d组p-Erk1/2和Caspase-3蛋白表达明显降低，顺铂对CAOV3细胞的IC50值明显降低，细胞凋亡率明显增加，细胞迁移率明显降低；而重组质粒转染+U0126d组上述改变更加显著。说明抑制Erk信号通路获得的效果与沉默KPNA2基因相似，而且二者联合时可进一步增加作用。提示KPNA2可通过Erk信号通路及其下游因子调控卵巢癌细胞的增殖、凋亡以及对顺铂化疗的敏感性。

综上所述，结肠癌转移相关基因KPNA2沉默后卵巢癌细胞的增殖、凋亡、侵袭力发生变化，对顺铂的敏感性增强。KPNA2可能通过Erk信号通路及其下游因子调控卵巢癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和顺铂敏感性。