基于耳石和角质颚微结构的中国枪乌贼年龄与生长比较

李建华，张鑫浩，金 岳，林方龙，陈新军

（1．上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306；2．大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室，上海 201306；3．国家远洋渔业工程技术研究中心，上海 201306；4．远洋渔业协同创新中心，上海 201306）

中国枪乌贼（Uroteuthis chinensis）又称本港鱿鱼、中国鱿鱼等［1］，隶属头足纲枪形目枪乌贼科枪乌贼属，为暖水性大陆架海域物种［2］。在我国主要分布于南海大陆架、台湾海峡中南部等海域［3］。中国枪乌贼在我国近海头足类产量中占较大比重，是我国的主要捕捞对象［3－4］。年龄与生长是研究头足类生活史最基本的内容之一，也是资源评估工作的基础［5］。头足类的耳石和角质颚是重要的硬组织材料，都具有生长纹结构［6－8］，在头足类的日龄、生长及生活史等［9－10］研究中得到广泛应用。耳石轮纹清晰规律，是研究头足类年龄和生长最为广泛和有效的硬组织材料，目前耳石制片方法、研究方法已经非常成熟［11－12］。角质颚轮纹位于角质颚内侧，随着越来越多的海洋生物工作者对其产生浓厚的兴趣，角质颚已逐渐成为除耳石外另一个研究头足类年龄的重要硬组织，其优点在于稳定的形态特征、良好的信息储存以及耐腐蚀等特点，学者对其应用前景十分看好［13－14］。因此，本研究根据2016年在南海北部陆架区采集的中国枪乌贼样本，分别利用耳石和角质颚微结构比较研究其年龄与生长特点，对耳石和角质颚的微结构及轮纹数进行差异性分析，并建立生长模型，以期为今后枪乌贼年龄与生长研究提供基础。

1 材料与方法

1．1 样本采集

中国枪乌贼的样品采集海域为南海北部陆架区（108°～118°E、20°～22°N），采集时间为2016年4月，样品通过拖网捕获，共随机采取274尾样本。

1．2 研究方法

1．2．1 生物学测定与耳石、角质颚的提取

实验室进行解冻后，对中国枪乌贼进行生物学测定，包括胴长（mantel length，ML）、体质量（body weight，BW）。测量胴长用皮尺进行，精确至1 mm，体质量精确至1 g。用镊子将左右两个耳石分别从平衡囊中取出，清洗后存放于2 mL离心管中，并加入75%的乙醇存放。

角质颚位于头部口球中，口器为几丁质，下颚包含着上颚，所以提取角质颚时应先取出下颚再取出上颚，角质颚取出后应用清水进行漂洗，去除附着于表面的有机物质，存放于50 mL离心管中，并加入75%的乙醇。

1．2．2 耳石、上角质颚切片制作

中国枪乌贼耳石背区的生长纹更加清晰［15］，故本研究选择背区面进行研磨。根据LIU等［16］对茎柔鱼的研究发现，角质颚微结构的生长纹位于喙部的矢状切面上，因此本研究取喙部进行研磨。由于中国枪乌贼个体小且角质颚较小，增大了角质颚的研磨难度。故本次研究实验只成功研磨出33尾中国枪乌贼样品的上角质颚，耳石研磨成功样品为173尾。

本次研究实验均使用Struers LaboPol－6研磨机。

1．2．3 轮纹计数

研磨好的耳石和角质颚切片放置在Olympus双筒光学显微镜（型号为CX21FS1）下，使用40倍物镜用DP71进行拍照；由于耳石以及角质颚的拍照在显微镜下无法一次完成，故采用多次拍照再使用Adobe Photoshop CS6对图片进行叠加拼合，最终得到完整的耳石与角质颚图片。每张样品图片上的生长纹计数由两位观察者分别进行，若计数的均值差异程度不高于10%，则视为该数据有效［17］。

1．2．4 数据的处理

1）处理耳石和角质颚的生物学数据，统计其胴长的频度分布，再建立胴长和体质量的4种函数关系：线性、指数、幂函数和对数函数，利用最小AIC法选择最适的生长模型。

2）对胴长体重生长模型、耳石生长纹的生长模型以及角质颚生长纹的生长模型进行差异分析。

本研究均利用SPSS 23．0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2．1 胴长与体重组成及其关系

如表1所示，本研究采集的中国枪乌贼样本胴长范围为66～476 mm，体质量范围14～767 g，胴长平均值为159 mm，体质量平均值为191 g。耳石日龄的范围为89～324 d，平均值为144 d。角质颚日龄的范围为70～197 d，平均值为127 d。

如图1所示，本次采集的中国枪乌贼样本胴长小于100 mm的占样品总数9%、100～200 mm占54%，200～300 mm占31%，大于300 mm占6%。其胴长组成符合正态分布。其中优势胴长组为100～200 mm。

胴长（ML）与体质量（BW）呈明显的幂函数生长关系，生长方程为：BW＝0．001 1ML2．2261（R2＝0．925 1）（图2）。

2．2 耳石微结构

观察发现，中国枪乌贼耳石的轮纹存在于吻区、翼区、背区和侧区，其中以背区的生长纹最为清晰。背区的微结构在显微镜下观察可区分中心核心、核心区、后核心区、暗区以及外围区这5个区域，且生长纹由明暗相间的环纹组成（图3）。核心区存在初始纹，初始纹较难观察。核心区以外的区域可根据生长纹的间隔宽度来区分出后核心区、暗区、外围区。后核心区的生长纹间隔较大，暗区的生长纹间隔最大，外围区的生长纹间隔最小。外围区是最难研磨和观察到生长纹的区域。

表1 中国枪乌贼胴长和体质量范围Tab．1 M antle length and weight range of U．chinensis

图1 中国枪乌贼胴长频率分布图Fig．1 Distribution ofmantle length frequency for U．chinensis

图2 中国枪乌贼胴长和体质量关系Fig．2 Relationship between mantle length and body weight for U．chinensis

图3 中国枪乌贼耳石背区微结构Fig．3 Dorsal dome statolith m icrostructure of U．chinensis

对中国枪乌贼耳石背区生长纹进行观察发现，亚日轮在暗区较常见 （图4－a），与日轮近乎重合，但亚日轮不如日轮明显。同时，还发现有6种不同的标记轮的存在，在核心区末端存在明显不同于其他生长纹的第1类标记轮（图4－b），出现在后核心区的第2类标记轮（图4－b），以及出现在后核心区和暗区过渡带的第3类标记轮（图4－b），第4类标记轮（图4－c）则出现在暗区和外围区之间，第5类标记轮在外围区（图4－c），第6类标记轮则出现在半月带或月带（图4－d）。

2．3 上角质颚的微结构

角质颚的生长纹存在于其内部，对中国枪乌贼的上角质颚进行纵面切割研磨，观察其在显微镜下的整体图（图5－a），发现角质颚喙部的头盖区生长纹和侧壁区生长纹以对称的形式排列在分叉到喙部分界线的两端。且其生长纹与耳石生长纹相似，以明暗相间的排列方式分布于角质颚喙部。并且明显观察到，头盖区的色素沉积相比于侧壁区要深很多。同样，角质颚的生长纹中也存在有亚日轮（图5－b）以及标记轮（图5－c），角质颚标记轮种类较耳石少。值得注意的是，角质颚标记轮附近的生长纹比其它生长纹更加明显，即暗带比其它暗带更暗，反之亮带更亮。观察整体的生长纹，发现从分叉到喙部，生长纹的间隔越来越小，生长纹越来越细。在角质颚喙部发现有异常结构，一般出现在喙部边缘（图5－d）。

2．4 年龄组成

耳石切片日龄范围为89～324 d，均值为144 d，耳石优势日龄组为 120～150 d，占总数的31．2%；其次是150～180 d和90～120 d，分别占总数的30．6%和26%，耳石日龄组成频度符合正态分布（图6）。角质颚切片日龄范围为70～197 d，均值为127 d。角质颚优势日龄组为90～120 d，占总数的39．4%；其次是120～150 d，占总数的24．2%，角质颚日龄组成频度也符合正态分布（图7）。

如表2所示，角质颚的生长纹数目明显小于耳石的生长纹数目，耳石生长纹数目小于200 d，角质颚生长纹数目与耳石生长纹数目较接近，但耳石生长纹数目大于200 d时，角质颚生长纹数目约等于耳石生长纹数目的一半。

2．5 耳石轮纹和角质颚轮纹与胴长的关系

对耳石和角质颚日龄的分析结果表明，耳石轮纹和胴长较为符合线性相关关系：N＝0．374 4ML＋71．326（R2＝0．850 4，P＜0．01）（图8）；

角质颚和胴长符合线性相关关系：

M＝0．266 4ML＋62．505（R2＝0．845 2，P＜0．01）（图 9）。

式中：N为耳石轮纹数，M为角质颚轮纹数，ML为胴长。

图4 中国枪乌贼耳石微结构生长纹Fig．4 Statolith m icrostructure of U．chinensis

图5 中国枪乌贼上角质颚微结构Fig．5 Upper beak m icrostructure of U．chinensis

图6 耳石年龄组成频度分布图Fig．6 Age frequency distribution of statolith

图7 角质颚年龄组成频度分布图Fig．7 Age frequency distribution of beak

图8 耳石轮纹与胴长关系Fig．8 Relationship between statolith increments and mantle length

表2 耳石和角质颚生长纹对照表Tab．2 Increment differences table for statolith and beak

图9 角质颚轮纹与胴长关系Fig．9 Relationship between beak increments and mantle length

3 讨论

3．1 耳石微结构

中国枪乌贼耳石微结构的生长纹排列方式和其它头足类耳石生长纹相似［18－19］，都是由明暗相间的环纹组成，且核心区内的初始轮纹不明显，观察计数有难度。研究发现暗区的条纹间隔宽度最宽，后核区次之，外围区间隔最窄，并且胴长个体越大越为明显，以此可以推断耳石微结构的各个区域的形成与中国枪乌贼的发育有关，这一结果与ARKHIPKIN［10］的结论相似。

在中国枪乌贼耳石中发现6类标记轮，这与前人对其它头足类耳石微结构的研究结果相似［20］，其中1～4类标记轮在各个区域的过渡带或者边缘，本研究认为标记轮代表着中国枪乌贼的生长变化规律。

3．2 上角质颚微结构

中国枪乌贼上角质颚生长纹与其它头足类相似［21］，都对称地分布在喙部截面纵轴的两侧，靠近分叉口附近生长纹间距宽，而靠近喙部生长纹间距窄。与喙部截面相比，侧壁区色素沉着浅，生长纹容易观察到，然而侧壁区的生长纹交错重叠现象严重，且侧壁区边缘常出现生长纹缺失，使得轮纹计数不准确，无法显示完整的生长纹。角质颚喙部生长纹的沉积是由分叉口开始向喙部沉积，靠近分叉口生长纹代表生长早期，生长速率快，靠近喙部生长纹代表成体期，生长速率慢，生长纹的变化趋势与中国枪乌贼的生长速率变化趋势一致。从图6－b可观察分析，角质颚喙部存在大量的色素沉积，色素过深的区域生长纹难以观察到，但是如果没有色素沉着，无法对生长纹进行观察，反而是透红的区域生长纹最为清晰。因此在研磨时要尽量将角质颚两面磨薄至色素透红，这样生长纹的观察会最清晰且计数准确。

在上角质颚的轮纹计数中发现与耳石微结构中相似的标记轮，角质颚标记轮的存在使得其附近的生长纹更为突出，而标记轮的生成与温度突变、风暴、被捕时逃脱等外界的环境影响有关［10］。本研究在观察角质颚生长纹的过程中，发现5尾中国枪乌贼的角质颚生长纹存在不平整的现象，有些区域的生长纹会突然出现弯曲不平整，随后又正常平整的排列，这可能是由于角质颚受到外界环境改变的刺激，从而使其沉淀作用混乱，待到沉淀作用正常后生长纹又开始规则的排列。角质颚微结构上出现垂直交叉于生长纹的细微条纹，这是由于角质颚的沉积作用会在不同的方向上进行［19］。角质颚喙部存在一些异常结构，由于角质颚存在于头足类口腔中，在捕食过程中其喙部易被腐蚀，导致腐蚀的位置无法进行生长纹的计数。因此可以通过观察其他区域的生长纹来减少喙部异常结构的影响。LIU等［16］的研究也表明，当出现影响生长纹计数的角质颚异常结构部位时，可以通过观察角质颚头盖背侧边缘的生长纹，从而减少误差。

3．3 耳石微结构和角质颚微结构比较

中国枪乌贼耳石和角质颚微结构有一定的相似性，两者都有生长纹的沉积，且在一定程度上可以反映个体年龄生长规律。标记轮的存在可能与其生存环境有关［17］。从生长纹的变化波动可以推测个体生存环境的大致变化，耳石和角质颚都有标记轮的存在，耳石标记轮种类较多，而角质颚标记轮种类较少，故从耳石生长纹上可以获得更多的生长信息。耳石和角质颚微结构同样存在日轮和亚日轮，日轮与亚日轮的存在是对其进行生长纹计数时产生误差的一个主要因素，所以需要仔细分辨亚日轮来减少判读误差。生长纹的计数准确度影响了其日龄的估算，对比本次耳石轮纹数和角质颚轮纹数发现，耳石轮纹数普遍比角质颚轮纹数高，这是由于角质颚微结构上生长纹会出现叠加沉积导致其轮纹数不全面，而且物种越小生长纹叠加现象越严重，同时喙部往往因为个体捕食等行为造成边缘磨损，进而造成轮纹缺失，导致以角质颚轮纹得到的日龄小于实际日龄。中国枪乌贼个体小于其它大多数头足类，其角质颚的生长纹较其他头足类难以观察。

3．4 胴长与体质量、耳石轮纹和角质颚轮纹关系

研究表明，中国枪乌贼的胴长与体质量关系符合幂函数生长模型，由胴长频率分布图（图1）及幂函数相关图（图2）可以发现，胴长为100～200 mm的个体占大多数；胴长为200 mm以下的中国枪乌贼样品平均体质量增加较慢，而胴长200 mm以上的则增长迅速。由此推断中国枪乌贼在胴长200 mm左右为快速成长期，随着性腺的不断成熟生长速度也变慢，符合大多数头足类的生长规律［10］。

胴长在300 mm以下个体的生长纹数较有规律，基本在参考线两侧；但是300 mm以上的个体则波动较大（图8，图9）。这与胴长仍受到体质量、发育以及捕食等很多因素的影响有关［22－23］。

综上所述，对于中国枪乌贼样品的年龄鉴定，建议选择耳石微结构来估算其日龄。在研究头足类年龄和生长的时候不能局限于只用一种方法，选择多种研究方法，对比分析各方法优劣，根据多种方法的结果讨论其原因，与使用单一的耳石微结构或角质颚微结构方法研究相比，两种研究方法的对比分析，可以更好的根据该物种的特性来对比研究得出较为准确的结果，从而选择更适合地材料和方法。因此，在今后的研究中，应不断改进头足类的年龄生长研究方法，使用耳石和角质颚微结构进行对比分析，使其研究结果更加准确和可靠。