板栗抗寒性相关指标筛选与评价方法建立

郭 燕，张树航，李 颖，张馨方，王广鹏，杨 阳

(河北省农林科学院 昌黎果树研究所，河北 昌黎 066600)

冻害是中国高纬度栽培区板栗常见的一种生理性病害[1]，板栗遭受冻害后，轻者造成不同程度减产，重者枝条或树体死亡，给生产造成重大损失。构建科学的抗寒性鉴定方法，准确评价种质抗寒性，筛选抗寒种质资源，对现有板栗种质利用、栽培区合理规划及抗寒良种选育具有重大意义。

植物抗寒性鉴定包括田间鉴定和室内鉴定两种方式。田间鉴定周期长，可控度低，受外界环境因素影响较大；而室内鉴定在可控环境下进行测量，具有操作简便、可控性强的优势，因此目前在植物的抗寒性鉴定上应用较多。国内外关于植物室内抗寒性鉴定与测试的方法很多，如电导法、组织褐变法、TTC染色法以及植物解剖特征和生理指标观测等。其中，电导法是木本植物上应用最广泛的一种抗寒性鉴定方法[2-4]，由于用电导法得到的相对电导率配以Logistic方程计算出的半致死温度 (LT50)与植物田间抗寒表现或冷害症状基本一致[5-6]，因此该方法已被广泛应用于葡萄、苹果、核桃等多种果树的抗寒性鉴定。组织褐变法是通过测定低温处理后组织的褐变情况来鉴定植物的抗寒性[7-8]，在葡萄、桃、核桃等多种果树上均已取得了较好的应用效果[9-11]。TTC染色法是通过测定低温处理后枝条的组织活力来判断其抗寒性[12-13]，在核桃、杜仲、茶树等植物上已证实该方法简单、可靠[11,13-14]。利用植物组织形态解剖特征也能鉴别其抗寒性[15]，如木质部、木栓层厚度及其在茎结构中所占比例，可以作为葡萄和核桃抗寒性鉴定的形态指标[11,16]。另外，植物在受到低温胁迫时，体内的相关生理指标会有所响应[17-18]，植物组织含水量、可溶性糖含量、MDA 含量、SOD 活性、POD 活性、膜脂肪酸组成等多个指标的变异特性，已被用于苹果、葡萄、核桃等树种的抗寒性鉴定[19-21]。

目前，有关板栗抗寒性鉴定的研究报道较少。陈楚莹等[22]通过板栗枝条的质壁分离程度、贮藏物质含量、蒸腾强度及低温下枝条受冻程度指标，比较了7个板栗品种的抗寒性。陈丽华[23]采用越冬调查法比较了10个板栗品种的抗寒性，分析了气候条件、树体生长状况与板栗抗寒性的关系。目前，有关电导法、组织褐变法和TTC染色法在板栗树种抗寒性鉴定上的应用效果尚未见报道。为此，本研究以8个省份的16个板栗品种(系)休眠期1年生枝条为材料，比较了3种方法在板栗抗寒性鉴定中的应用效果，分析了各相关生理指标和组织结构与抗寒性的相关性，以期建立准确可靠的板栗抗寒性评价方法，筛选可用于板栗抗寒性鉴定的形态和生理指标，为我国板栗种质的抗寒性鉴定、抗寒育种及现有品种栽培区划提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以源自8个省份的16个板栗品种(系)休眠期1年生枝条为试验材料，其基础资料见表1，供试材料全部取自河北省昌黎果树研究所板栗种质资源圃，栽植株行距 2 m×4 m，树龄13年，树体修剪、肥水管理及病虫害防控等措施一致。

1.2 试验处理

2015年1月15日，每品种随机选取30株树，于每株树冠外围随机剪取粗度基本一致的一年生休眠期枝条10根。将剪取的枝条按品种混合后，先后用自来水、蒸馏水冲洗干净。之后每品种随机选取30～35根枝条为1份，共取7份分别放入自封袋中，在袋中加入适量水密封，其中6份分别置高低温交变湿热试验箱中进行不同冷冻温度处理。试验共设-10，-15，-20，-25，-30，-35 ℃ 6个低温处理，每处理均以4 ℃/h的速率降温，达到设定温度后保持12 h，再以4 ℃/h的速率升温至4 ℃保持2 h，后放入4 ℃冰箱中备用。另1份枝条直接置于4 ℃冰箱中作为对照(CK)。各项指标测定前均将冷冻枝条置于室温(25 ℃) 下8 h。每处理随机选取3根枝条为1个重复，共3个重复。

表1 供试板栗品种(系)的基础资料Table 1 Chestnut varieties (strains) tested in this study

1.3 测定指标及方法

1.3.1 相对电导率 相对电导率采用电导法测定[10]。将样品枝条切成 0.5 cm小段，称取2.0 g置于25 mL试管中，加入去离子水 25.0 mL，盖好瓶塞，于摇床上 25 ℃振荡浸提12 h，用 DDS-11C型数显电导率仪测定各样品浸提液的电导值(C1)。再将样品浸提液在沸水中加热 25 min 杀死组织，25 ℃下浸提12 h，测定总电导值(C2)。然后计算相对电导率：相对电导率(REC)=C1/C2×100%。

1.3.2 枝条冻害指数、芽褐变率及组织活力 枝条冻害指数采用组织褐变法[11]测定。冻害指数的分级标准参照贺普超等[24]的方法但略有改动。从冷冻枝条节间中部截断，观察枝条不同组织截面低温处理后的褐变情况，确定冻害级次。冻害级次分级标准为：0 级，无冻害，髓部绿色，木质部绿色，韧皮部绿色；1 级，轻微冻害，髓部白色，原生木质部部分变褐，韧皮部绿色；2 级，髓部白色，木质部大部分褐色，韧皮部绿色；2.5 级，髓部白色，木质部全部褐色，韧皮部部分褐色；3级，髓部白色，木质部全部褐色，韧皮部全部褐色。按级别进行统计，用冻害指数反映各品种枝条的受冻程度：冻害指数=∑(冻害级次×枝段数)/(4×枝段总数)。

芽褐变率的统计参照田景花等[11]的方法进行，计算公式为：芽褐变率=褐变芽数/总芽数×100%。

枝条组织活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定[14]。低温处理后，从各枝条上切取长0.4 cm的小段，每个种质取10段，放入50 mL 0.5%的TTC溶液中，于黑暗中静置 15 h，观察木质部着色情况。抗寒力以着色程度表示，着色越深，表示抗寒力越强，未着色记为0，淡红色记为1，粉红色记为2，红色记为3。总着色度的计算公式为：总着色度=∑(着色程度×枝段数)/枝段总数。

1.3.3 枝条组织结构 枝条组织结构观测参照田景花等[11]的方法并略有改动。每个品种随机选取洗净的4 ℃环境下(对照)的枝条30根，先用游标卡尺在枝条中部的节位之间测量枝条直径及髓直径，然后测量去皮后枝条直径(仅包括木质部和髓)，计算木质部厚度和髓半径：木质部厚度=(去皮后枝条直径-髓直径)/2,髓半径=髓直径/2。自每品种枝条中部切取0.3 cm×0.3 cm大小的树皮30片，FAA固定液固定，Leica冷冻切片机(Leica CM1850)切片，厚度15～18 μm，番红-固绿染色，石蜡封片。Olympus BX-51显微镜观察树皮横切面解剖结构并拍照，以目镜测微尺测量木栓层厚度，并计算木栓层在茎结构中所占的比率：木栓层比率=木栓层厚度/枝条半径×100%。

1.3.4 生理指标 MDA含量采用硫代巴比妥酸TBA显色法[25]测定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮显色法[25]测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法[26]测定。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2003进行处理。参照莫惠栋[27]的方法，将不同温度处理下的相对电导率、枝条冻害指数、总着色度和芽褐变率，分别用改进的Logistic方程y=K/(1+ae-bx)拟合，求该方程的二阶导数并令其等于0，可获得方程曲线的拐点x，即为半致死温度LT50。数据的相关性分析和差异显著性测验采用SPSS 20.0进行。

2 结果与分析

2.1 基于电导法的板栗枝条抗寒性鉴定

不同冷冻温度处理下，16种板栗枝条的相对电导率及由其拟合的低温半致死温度(LT50)见表2。由表2可以看出，随冷冻温度的降低，细胞膜透性增加，电解质外渗增多，16个板栗品种(系)枝条相对电导率均近似呈“S”型变化趋势，说明板栗枝条对低温胁迫的响应具有一致性，其细胞电解质外渗量随温度的降低呈现“缓慢增加→急剧增加→保持平稳”的变化趋势，但不同板栗品种电解质外渗趋势出现明显变化拐点时所处的温度各不相同。

LT50是指在该温度时植物处于半致死状态，当温度继续低于该温度时，植物所受的伤害将不可恢复甚至死亡[25]。由表2可见，16个板栗品种(系)的LT50差异较大，其值为-26.64～-17.73 ℃，部分品种间的差异达到显著水平，说明基于电导法的LT50可以很好地区分板栗休眠期1年生枝条的抗寒性。

表2 低温处理下板栗枝条的相对电导率及其低温半致死温度(LT50)Table 2 Relative electrical conductivities and estimated LT50 of chestnut branches under different low temperatures

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，表6同。

Note:Different lowercase letters in each row mean significant difference(P<0.05),the same for Table 6.

将各品种不同冷冻温度处理的相对电导率与LT50进行相关性分析，结果见表3。由表3可以看出，除对照(4 ℃)外，-10～-35 ℃ 6个低温冷冻处理枝条的相对电导率均与其LT50呈极显著正相关，相关系数分别为0.640，0.782，0.960，0.915，0.909和0.942，其中以-20 ℃处理的相关系数最高,为0.960。

表3 各低温处理下板栗枝条的相对电导率与其低温半致死温度(LT50)的相关性Table 3 Correlation between relative electrical conductivities and LT50 of chestnut branches under different low temperatures

注：* 表示在P<0.05水平显著相关，**表示在P<0.01水平显著相关，下同。

Note: *means significant atP<0.05，** means significant atP<0.01，The same below.

2.2 基于TTC染色法及组织褐变法的板栗枝条抗寒性鉴定

基于组织褐变法,对16个板栗枝条休眠期1年生枝条组织的褐变情况进行观察，不同冻害级别的冻害症状如图1所示。

A～E.冻害级别分别为0，1，2，2.5,3级的枝条A～E.5 freezing injury levels (0,1,2,2.5,3 class) of branches

从图1可以看出，不同组织对冻害的响应症状不同，髓部受冻后变白色，木质部和韧皮部受冻后变褐色，并且不同组织的抗寒性有明显差异，依据不同组织开始发生冻害时温度的高低，判定板栗枝条组织抗寒性强弱顺序为韧皮部>木质部>髓部。本试验中，当冷冻温度达到电导法拟合的LT50时，可以明显观察到枝条木质部大部分发生褐变，表明低温胁迫下的木质部大部分褐变可以作为枝条半致死的一个形态标记。

不同冷冻温度处理下16个板栗品种(系)枝条的总着色度、冻害指数和芽褐变率数据表明，16个板栗品种的3个指标随处理温度下降的变化规律基本一致，以燕山早丰板栗为例，3个指标的变化规律如图2所示。由图2可见，板栗枝条TTC染色的总着色度随处理温度的下降呈倒“S”型曲线变化，而枝条的冻害指数和芽褐变率均随温度下降呈“S”型曲线变化。用改进的Logistic方程拟合温度拐点，得到基于3个指标各品种枝条的 LT50见表4。由表4可以看出，各板栗品种基于3个指标拟合的LT50基本一致，且与电导率法拟合的LT50接近。

图2 不同低温处理下燕山早丰板栗枝条的总着色度、枝条冻害指数和芽褐变率Fig.2 Changes of dyeing degree, branch freeze injury index and bud browning rate of Yanshanzaofeng under different low temperatures

表4 低温处理后基于板栗枝条总着色度、冻害指数及芽褐变率3个指标拟合的LT50Table 4 LT50 estimated by dyeing degree, freeze injury index of branches and browning rate of buds under different low temperatures ℃

2.3 3种抗寒性鉴定方法所得LT50的相关性分析

将基于电导法、TTC染色法、组织褐变法拟合的LT50分别进行相关性分析，结果见表 5。

表5 3种鉴定方法所得LT50 之间的相关性Table 5 Correlation of LT50 estimated by different methods

由表5可以看出，3种方法确定的LT50之间均呈极显著正相关。说明利用电导法、TTC 染色法、组织褐变法对板栗 1 年生枝条抗寒性的鉴定结果较为一致，方法均比较可行。

2.4 不同板栗枝条组织结构与抗寒性的关系

16个板栗品种枝条木质部厚度、木栓层厚度和髓半径、枝条半径及木质部比率、木栓层比率的测定结果见表6。由表6可以看出，16个板栗品种(系)1 年生枝条上述各指标差异均较大。16个品种(系)的木质部厚度为1.59～3.17 mm，其中最大值是最小值的2.0倍；木栓层厚度为14.60～32.10 μm，最大值是最小值的2.1倍；髓半径为0.72～0.94 mm，最大值是最小值的1.3倍；枝条半径为3.13～4.78 mm，其中最大值是最小值的1.5倍；木质部比率为42.54%～66.37%，最大值是最小值的1.6倍；木栓层比率为0.40%～0.89%，最大值是最小值的2.2倍，其中燕山早丰、燕宽、燕金、燕兴和辽宁2号之间木栓层厚度差异不明显，但均显著高于其他品种。

表6 16个板栗品种(系)1 年生枝条组织结构指标的测定Table 6 Average values of anatomical structures of annual branches of 16 chestnut varieties(strains)

将16品种(系)木质部厚度、木栓层厚度、髓半径、枝条半径以及木质部比率和木栓层比率的测定结果与相对电导率拟合的LT50进行相关性分析，结果见表7。由表7可以看出，板栗 1 年生枝条的木质部厚度、髓半径和木质部比率与其LT50呈正相关，但相关性未达到显著水平；而木栓层厚度和木栓层比率与其 LT50呈极显著负相关，相关系数分别为-0.960和-0.874。可以认为，木栓层越厚，其在茎结构中所占比率越大，抗寒性越强，因此1年生枝条木栓层厚度及其在茎结构中所占的比率可作为板栗休眠期抗寒性鉴定的形态结构指标。

表7 低温处理下板栗枝条组织结构与相对电导率拟合LT50的相关性Table 7 Correlation between anatomical structure and LT50 of chestnut branch under different low temperatures

2.5 板栗枝条生理指标与其抗寒性的关系

将不同温度冷冻处理的16个板栗品种(系)枝条的丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量测定结果与基于电导率拟合的LT50进行相关性分析，结果见表8。

表8 低温处理下板栗枝条生理指标与相对电导率拟合的LT50的相关性Table 8 Correlation between physiological index and LT50 of chestnut branch under different low temperatures

由表8可以看出，各冷冻温度下枝条脯氨酸、可溶性糖含量与电导率拟合的LT50均无显著相关性，而在-15，-20和-25 ℃冷冻温度处理下，枝条丙二醛含量与电导率拟合的LT50呈极显著正相关，说明1年生枝条的丙二醛含量越低，LT50也越低，其抗寒性越强，其中以-20 ℃冷冻温度下的相关系数最高，r=0.875。

3 讨 论

在植物抗寒性鉴定中，经最适冷冻温度处理后的相关抗寒指标差异较大，可以将植物抗寒性强弱区分开来，因此确定最适冷冻温度是准确评价植物抗寒性的先决条件。何伟[3]认为，-36 ℃处理下不同山葡萄相对电导率的差异达极显著水平，-36 ℃可以作为鉴定山葡萄抗寒性的最适冷冻温度。田景花等[11]认为，-24 ℃处理后核桃枝条的相对电导率与其 LT50表现为极显著正相关，LT50和-24 ℃处理下的相对电导率均可作为鉴定休眠期核桃抗寒性的物理指标。本研究结果显示，经-20，-25和-30 ℃处理后,板栗枝条的相对电导率与其 LT50均呈极显著正相关，其中以-20 ℃处理下的相关系数最高(r=0.960)。枝条丙二醛含量在-15，-20和-25 ℃处理下与LT50呈极显著正相关，其中也以-20 ℃温度下的相关系数最高(r=0.875)。说明-20 ℃是鉴定板栗1年生枝条抗寒性的最适冷冻温度。综合对比各品种LT50可以发现，-20 ℃正是略高于大部分板栗品种LT50的温度，因此-20 ℃冷冻处理下的相对电导率和丙二醛含量可以分别作为休眠期板栗抗寒性鉴定的生理指标。

木本植物组织结构不同，抗寒性有明显差异。其中木栓层、木质部与髓均是果树枝干的重要组成部分，其体量大小和所占比率与抗寒性密切相关[28]。前人研究表明，桃、仁用杏和蜡梅1年生枝条木质部比率与抗寒性呈显著正相关[29-31]，而樱桃枝条木质部厚度及木质部比率与抗寒性无相关性，韧皮部厚度与抗寒性呈正相关[32]；核桃、柑桔、葡萄则表现为木栓层比率越高，抗寒性越强[11,15,33]。本研究中，板栗1年生枝条木质部厚度、木质部比率和髓半径与其LT50均无显著相关性，不宜作为鉴定休眠期板栗抗寒性的形态指标；而木栓层厚度及木栓层比率与其LT50呈极显著负相关，说明板栗木栓层越厚或比率越高则抗寒性越强，因此木栓层厚度和木栓层比率可以作为鉴定休眠期板栗抗寒性的形态指标，此研究结果与前人的研究结果[11,15,33]一致。

电导法、TTC染色法、组织褐变法和抗寒生理指标分析法是目前植物抗寒性鉴定中常用的方法，其基本原理不同，在应用过程中也各有优缺点。本研究结果表明，由电导法、TTC染色法、枝条和芽褐变法确定的各板栗品种1年生枝条的LT50基本一致，并呈极显著正相关，但不同品种间LT50却差异明显，说明电导法、TTC法、组织褐变法均可用于板栗树种的抗寒性鉴定，并能准确区分不同品种间抗寒性的强弱。然而，在实际测定过程中，组织褐变法及TTC染色法在目测褐变程度和着色程度时易受人为主观性的影响，导致误差较大，为达到良好的重复效果，需要操作者具备熟练的实验技巧，对于初试者来说取得准确测定结果的难度较大，因此认为基于电导法测定板栗抗寒性的结果最为准确，在熟练掌握实验技巧的前提下，可将组织褐变法和TTC染色法作为一种快捷评价方法对电导法加以补充确认。因此建议在鉴定板栗种质抗寒性时，优先选用电导法，但应将其与组织褐变法、TTC染色法及丙二醛含量等测定指标结合起来综合考虑，结果将更为可靠、准确。

4 结 论

电导法、组织褐变法及 TTC 染色法均可用于休眠期板栗树种的抗寒性鉴定，且以电导法测定的结果最为准确；同时，可将枝条木栓层厚度与木栓层比率作为形态指标，将-20 ℃冷冻温度处理下的枝条相对电导率(REC)和丙二醛含量作为生理指标对板栗抗寒性进行辅助判断。