AQP1、HBx蛋白在乙肝相关性肝癌组织中的表达及其意义

雷阳，李跃文

(1、信阳市中心医院检验科，河南 信阳 464000；2、驻马店市第一人民医院检验科，河南 驻马店 463000)

乙肝相关性肝癌的发生，考虑与长期的乙肝病毒的感染导致的肝细胞的异常病变有关，流行病学研究显示，乙肝相关性肝癌的发病率可达234～466/10万人左右[1]，在合并有家族内肝癌病史或者胆道系统疾病的人群中，乙肝相关性肝癌的发病率可进一步上升。不同的生物学因子能够通过影响到癌细胞的生物学特征，促进癌细胞在增殖、分化或者凋亡等过程中的调控异常，进而促进肿瘤早期的发生及临床进展。水通道蛋白1（APQ1）不仅能够参与到水电解质的代谢过程中，同时可以影响到局部组织新生血管的形成、提高局部血管内皮的通透性，为癌细胞的扩散或者浸润提供基础[2]；乙肝病毒基因X开放读框编码的乙肝病毒X蛋白（HBx）能够提高乙肝病毒整合入宿主喜碧的速度，提高乙肝病毒颗粒的毒性作用，提高癌细胞持续性增殖的风险[3，4]。部分研究探讨了APQ1与肝癌的关系，认为异常表达的APQ1是促进患者肝癌临床分期进展的重要因素，但对于HBx与乙肝相关性肝癌的关系研究不足。为了进一步揭示相关因子在促进肝癌病情进展过程中的作用，本研究选取我院手术后肝癌组织标本80例，探讨了AQP1、HBx蛋白的异常表达情况及其与患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院手术后肝癌组织标本80例（病灶组）、40例癌旁组织（癌旁组），收集时间2015年1月-2017年6月。病灶组，男44例、女36例，年龄 42～73 岁，平均 57.5±10.1 岁，分化程度：高分化18例、中分化35例、低分化27例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期28例、Ⅲ期32例；病灶直径＞5cm 34例；发生淋巴结转移32例。癌旁组，男22例、女 18例，年龄 44～71岁，平均 56.6±10.0岁。两组患者的年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 纳入排除标准

1.2.1 纳入标准 ⑴肝癌的诊断标准参考中华医学会制定的诊断标准；⑵患者均具有明确的HBV病毒感染病史或HBV-DNA检测阳性；⑶患者均在我院接受肝癌根治性手术；⑷患者手术治疗前未经行放化疗治疗；⑸本研究获得医学伦理委员会的批准。

1.2.2 排除标准 ⑴转移性肝癌；⑵未经病理学证实；⑶手术前患者因肝癌或其他部位肿瘤已经接受了放化疗；⑷风湿及免疫系统疾病。

1.3 免疫组化染色方法 所有组织标本经石蜡包埋后作连续切片，厚度约为4mm，采用免疫组化链霉卵白素一生物素复合体法 (strep avidin-biotin complex，SABC法)染色，二氨基联苯胺(diamionben zidene，DAB)显色。 APQ1、HBx 抗体、PV6000 通用型二抗以及SP试剂盒和DAB显色盒均购自北京中杉金桥生物技术开发公司。以阳性片及PBS代替一抗分别作为阳性及阴性对照，高倍显微镜下观察APQ1、HBx的表达情况，具体染色步骤严格按照SP试剂盒说明书进行操作。

1.4 免疫组化判定标准 免疫组化结果判定：APQ1、HBx蛋白的阳性着色表达于细胞膜、细胞质，呈黄色、棕黄色、褐色表达，⑴根据着色强度：0分为无色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为褐色、黑色；⑵根据阳性细胞比例：阳性细胞数目所占比例≤10%为1分、阳性细胞所占比例11%～50%为2分、阳性细胞数51%～75%为3分、阳性细胞数所占比例＞75%为4分，两种积分相乘总分＜3分为阴性、≥3分为阳性。总分＜3分：“-”表达；为3～5 分，“+” 表达；为 6～9 分，“++” 表达；＞9 分，“+++”表达。。

1.5 统计学方法 统计软件采用SPSS 16.0，采用均数±标准差（±s）进行统计描述，两组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；P值＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组组织标本中的APQ1、HBx蛋白表达情况比较 病灶组的APQ1、HBx蛋白表达阳性率分别为71.25%、68.75%均显著的高于癌旁组的5.00%、10.00%（P＜0.05）；见表 1、表 2。

表1 两组组织标本中的APQ1蛋白表达情况比较

表2 两组组织标本中的HBx蛋白表达情况比较

2.2 肝癌组织标本中的APQ1、HBx蛋白表达与患者临床病理学特征的关系 肝癌组织中APQ1蛋白表达与患者TNM分期、发生淋巴结转移、肿瘤分化程度具有显著的相关性（P＜0.05）；肝癌组织中HBx蛋白表达阳性率与肿瘤发生门脉侵袭、TNM分期、发生淋巴结转移具有显著的相关性 （P＜0.05），见表 3、表 4。

3 讨论

肝癌的发生可能与饮食习惯、遗传、病毒感染等因素有关，合并有慢性乙型肝炎病毒感染的人群，由于长期的病毒颗粒表面糖蛋白激活导致的细胞内信号通路的异常传导，能够增加肝脏上皮细胞的异常病变的风险[5，6]。乙肝相关性肝癌的患者，其病情进展较为隐匿，容易早期发生腹腔内脏器的转移[7，8]。长期的临床随访研究显示，乙肝相关性肝癌的临床治疗总体有效率不足35%，治疗后患者无瘤生存时间或者五年生存率等指标均无明显的改善[9]。而本次研究通过对于乙肝相关性肝癌发病过程中不同因子的表达分析研究，能够为乙肝相关性肝癌的免疫靶向治疗提供理论参考，同时可以为临床上乙肝相关性肝癌的预后随访提供较为可靠的参考指标。

表3 肝癌组织标本中的APQ1蛋白表达与患者临床病理学特征的关系

表4 肝癌组织标本中的HBx蛋白表达与患者临床病理学特征的关系

APQ1作为四通道蛋白，其通道的开放能够平衡细胞膜内外的液体代谢，稳定细胞内外的渗透压、离子电势差等必要时的内环境。已经证实的APQ1能够在影响到泌尿系统疾病的发生及病情进展过程中发挥重要的作用，而近年来相关基础方面的研究显示，APQ1还能够在影响到肿瘤微环境的形成，提高肿瘤干细胞的活性，促进肿瘤细胞早期粘附及浸润等病理过程进展中起到作用。APQ1能够通过对于血管内皮细胞生长因子a的上调作用，提高早期异常病变肝脏病灶组织细胞的血流灌注，提高肿瘤细胞的增殖活性[10]；HBx对于肿瘤相关基因的上游启动子区域激活作用，能够促进下游癌细胞周期的调控障碍，增加G1/S期的细胞比例，促进癌细胞的分化障碍，增加低分化及凋亡抑制的发生风险[11，12]。本研究在探讨了APQ1、HBx蛋白与肝癌患者临床分期、淋巴结转移、细胞分化等关系的同时，揭示了其与患者薄膜浸润、门脉转移的关系。

本研究发现，在肝癌患者病灶组织中可以发现APQ1、HBx蛋白的显著异常表达，其表达浓度的上升提示二者可能均参与到了肝癌的发生发展过程中，从机制上考虑APQ1、HBx蛋白的异常表达与乙肝相关性肝癌的关系可能与下列几个方面的因素有关：⑴APQ1的高表达能够直径促进癌细胞早期对于血管内皮细胞的粘附能力，促进癌细胞线粒体氧化损伤，降低染色体错配修复的能力；⑵HBx蛋白的高表达能够导致导致癌细胞内NOTCH或者AKT等信号通路的传递异常，增加肿瘤信号通路的交错式激活。王鹏等[13，14]研究者在探讨了不同病情的肝癌患者的临床预后过程中发现，肿瘤组织异型性较为明显，新生血管形成较为明显的区域，HBx蛋白的表达均可以显著上升，同时在临近肝癌癌旁组织的区域，HBx蛋白即可发现显著的表达变化。在临床分期较晚的患者中，APQ1的表达阳性率较高，这主要与APQ1的表达对于肝癌患者的器官转移、局部临床正常组织的浸润过程有关；在细胞分化程度较差或者发生了淋巴结转移的人群中，APQ1蛋白的表达阳性率可进一步上升，这主要考虑与APQ1蛋白的高表达对于淋巴结引流、血管内皮粘附分子或者淋巴结组织粘附分子adherin 1的表达上调有关[15]。但本次研究并未发现APQ1蛋白的表达与肝癌患者肿瘤大小或者门脉浸润的关系，这因为肿瘤病灶的大小主要与肿瘤的病情进展时间、病程长短有关系，而APQ1蛋白的表达并不会影响到门脉浸润，则提示APQ1蛋白在肝小叶中央区域可能并不具有显著的致癌作用。肝癌组织中HBx蛋白表达阳性率与肿瘤发生门脉侵袭、TNM分期、发生淋巴结转移具有显著的相关性，表明HBx蛋白与肝癌的临床病情同样具有密切的关系，其中HBx蛋白对于门脉浸润的影响，提示HBx蛋白与肝癌患者的病情关系更为密切。

综上所述，APQ1、HBx蛋白在乙肝相关性肝癌组织中高表达，并且与肿瘤的发生发展关系密切。