替加环素不敏感肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性分析及检测方法评价

钟希 ，钟桥石 ，程枫 ，丁慧 ，杭亚平

(1、萍乡市第二人民医院检验科，江西 萍乡337000；2、南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌 330006；3、江西省胸科医院检验科，江西 南昌330006)

肺炎克雷伯菌为院内感染常见重要致病菌， 对临床常用抗菌药物多呈高度耐药，多重耐药和广泛耐药菌株检出率近年来有所上升[1]。临床亟需一种能克服现有耐药机制的全新药物。替加环素是用于临床的新型甘氨酰四环素类广谱抗生素，能有效抑制碳青霉烯酶类耐药细菌引起的感染[2]。然而，近几年替加环素的耐药株不断出现[1，3-5]，使得替加环素的耐药问题也越来越受到关注，但研究主要集中于鲍曼不动杆菌。有关肺炎克雷伯菌替加环素耐药情况国内报道较少。与此同时，我国采用的美国临床实验室标准协会(CLSI)标准并未推荐适合临床微生物实验室常规使用的检测替加环素敏感性的方法。然而，临床需要依据体外药敏试验来确定用药方案。因此，我们探讨肺炎克雷伯菌对替加环素药敏试验的常用检测方法及其耐药情况，以期为临床合理应用替加环素提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 从2016年1月17日至2016年4月15日南昌大学第二附属医院临床分离的108株肺炎克雷伯菌中，收集非重复的替加环素不敏感的肺炎克雷伯菌共34株。

1.1.2 仪器与试剂 VITEK2-Compact全自动细菌分析仪及配套鉴定卡和药敏卡，法国生物梅里埃公司产品；水解酪蛋白(MH)琼脂购于Oxoid公司；替加环素的E-test条 (0.016-256ug/ml)，瑞典AB Biomerieux公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定及药敏试验 经VITEK2-Compact对所有菌株进行鉴定及药敏检测，筛选出替加环素不敏感菌株，再进行E-test条检测，操作步骤同K-B药敏纸片法。质控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603、霍氏肠杆菌ATCC700323和金黄色葡萄球菌ATCC29213对MH培养基及E-test条进行质控。药敏结果参照美国食品药品监督局(FDA)判断标准进行判读，即MIC≤2ug/ml为敏感(S)、4ug/ml为中介(I)、≥8ug/ml为耐药(R)。

1.2.2 统计学分析 SPSS 20.0进行统计学分析，采用χ2检验比较相同判读标准的两种方法得到的敏感、中介及耐药率。

2 结果

2.1 替加环素不敏感菌株对14种常见抗菌药物的耐药特性 分析显示，16株肺炎克雷伯菌对常见抗菌药物的耐药性严重，其中对环丙沙星和左旋氧氟沙星耐药率100%；对头孢曲松、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢西丁、庆大霉素、亚胺培南、磺胺甲基异噁唑、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸和氨曲南耐药率高达80%以上；对阿米卡星和妥布霉素耐药率大于65%，详见表1。

2.2 两种方法检测结果一致性比较 据CLSI标准分类一致性(CA)定义为被评估方法与E-test法药敏结果判断为一致的菌株百分比。VITEK2法与E-test法药敏结果判读为一致的菌株百分比为17.6%(6株)，不敏感判读一致性的菌株百分比为47.1%（16株）两种方法的药敏结果一致性偏低。

2.3 两种方法测定不同菌株对替加环素的药敏结果 34株肺炎克雷伯菌经VITEK2法检测，得到18株耐药株(61.8%)，经E-test法确认后，显示7株敏感、10株中介、1株耐药。而 16株中介株(38.2%)，经E-test法确认后，显示 11株敏感、5株中介。两种检测方法对替加环素药敏结果的差异具有统计学意义(P＜0.01，χ2值 36.33)，详见表 2。

2.4 E-test法确认后替加环素不敏感菌株的产酶特性 产ESBLs的肺炎克雷伯菌与非产ESBLs的肺炎克雷伯菌对替加环素的敏感性结果显示，存在统计学差异 (P＜0.01，χ2值 8.54)，ESBLs+肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药性比ESBLs-肺炎克雷伯菌更严重。碳青霉烯类不敏感肺炎克雷伯菌(CRKP)和敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)对替加环素的敏感性比较得到存在统计学显著差异 (P＜0.01，χ2值9.62)，后者对替加环素耐药更严重，详见表3。

表2 两种检测方法对替加环素耐药率的检测结果比较（%）

表3 不同产酶情况下肺炎克雷伯菌对替加环素耐药率及其耐药率的比较（%）

3 讨论

替加环素抗菌谱广，抗菌活性强，无论对G+菌还是对G-菌以及需氧菌和厌氧菌均有非常强的抗菌活性。作为首个被批准用于临床的静脉内给药的甘氨酰环素类抗生素，替加环素主要是通过限制细菌对药物的外排作用和核糖体保护这两种耐药机制产生超强的抗菌活性效应，为多重耐药菌甚至“超级细菌”的抗感染治疗提供了新手段。近年来，多重耐药菌对替加环素的耐药也越来越严重。在美国，多重耐药肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药率为9.2%(MIC28mg/L，FDA[6])，而在西班牙产ESBLs的肺炎克雷伯菌的替加环素耐药率为33.3%(MIC＞2mg/L，EUCAST[7])。 显然与碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的日益增多和替加环素使用的增加[8]密切相关。我院在2015年之前还未见肺炎克雷伯菌对替加环素耐药情况的报道[9]，肺炎克雷伯菌短时间内出现较多对替加环素不敏感菌株，应引起感染控制部门的高度重视，是否存在同源性菌株播散，有待进一步研究。

有研究报道，AcrAB外排泵基因的高表达可同时引起肠杆菌科细菌对替加环素、四环素和喹诺酮类抗生素MIC值的升高[2]。此外，越来越多的证据表明耐药株可以通过质粒介导的外排泵基因使得耐药基因在不同种属菌株之间进行水平传播[10]。因此，替加环素耐药菌株的不断出现，可能与外排泵基因密切相关。表1显示出我们筛选的16株替加环素不敏感肺炎克雷伯菌耐药性普遍严重，很难为临床用药提供经验参考，同时表明细菌共同携带的耐药表型和耐药机制日趋多样化、复杂化。外膜蛋白缺失仅仅使碳青霉烯类药物的MIC升高并不能达到耐药折点，合并产ESBLs可产生高水平耐药，因此ESBLs高产率菌株会导致更多的对碳青霉烯类药物耐药[11]。本研究结果显示ESBLs+肺炎克雷伯菌和CSKP对替加环素的耐药性更严重，可推测ESBLs+菌株会表现出对替加环素的交叉耐药，也支持了替加环素可用于治疗CRKP感染的可行性。

临床上检测替加环素的体外活性的方法很多，但常常因各种客观条件而影响结果的准确性[12]。现在临床上检测替加环素的体外活性的方法以微量肉汤稀释法（BMD）为参考标准；在鲍曼不动杆菌中，经E-test法和BMD获得的替加环素MIC结果可能不一致[13]；在肺炎克雷伯菌中，两种方法检测的替加环素MIC结果一致性较好。本实验结果表明VITEK2法检测肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药率假性偏高，与国内外报道一致[13]。因此，进一步证实VITEK2法不能作为检测肺炎克雷伯菌对替加环素敏感性的常规方法，尤其是对于产ESBLs肺炎克雷伯菌和碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌，宜采用E-test法对替加环素不敏感菌株进行复核，避免误差，为临床合理用药提供可靠的依据。