环境因素对丰年虾孵化的影响及孵化条件优化

欧阳娟，薛松磊，徐 妍，沈 晖，崔恒宓

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009）

丰年虾（Artemia salina）又称卤虫、丰年虫，是一种体长为1～2 cm的小型甲壳类动物，主要生活在高盐度水域中，生活环境物种多样性低，营养结构较为简单（Browne等，2018）。其适应能力、繁殖能力和休眠卵抗逆性强，孵化时间较短，只需18～30 h（Gajardo等，2012）便可孵化成无节幼虫。因为丰年虾无节幼虫体内含有多种蛋白质和丰富的营养物质，经常作为水产动物苗种的开口活饵料（黄旭雄，2007）。研究表明，作为水产动物苗种的开口活饵料能提高幼鱼存活率（王卫军等，2017），还可以为水产养殖中传染病治疗研究提供工具（Torres等，2018）。

虾卵孵化与温度、盐度、pH等因素有关（景素琴等，2016；李景等，2013；曾宪英等，2004），以往研究通常会对某种单独孵化条件进行探索，得出大致范围，但对丰年虾较优的孵化方案研究较少。本文通过设计单因素和正交试验，研究温度、盐度、pH及孵化时间对丰年虾孵化率的影响，最后得出较为准确的孵化方案，旨在为优化丰年虾孵化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 试验用可孵化丰年虾卵购自厦门华普水产开发有限公司。通过体视显微镜筛选高质量丰年虾虾卵，准确称取2 g虾卵，约为3.49×105个。

1.2 试验方法 温度试验：设置5个温度梯度，分别为 24、26、28、30、32℃。利用恒温加热器控制水温，待水温稳定后进行后续试验，试验设置3个重复。

pH试验：设置7个pH梯度，分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10。分别利用 NaOH、NaHCO3调节pH至相应值，试验设置3个重复。

盐度试验：设置7个盐度梯度，分别为5、10、15、20、25、30、35，分别利用海盐调节盐度。盐度单位为g/L，以下均用‰表示，试验设置3个重复。

孵化时间试验：设置5个时间梯度，分别为20、22、24、26、28 h。从放入丰年虾开始孵化和停止孵化为时间间隔，试验设置3个重复。

通过单因素试验得出每个试验的最佳水平，选取最佳水平及其前后两水平，进行四因素三水平正交试验。

1.3 计算方法 丰年虾孵化率公式如下

孵化率=n/N×100%；

式中，n1、n2、n3，分别代表 3个重复试验中每毫升孵化液中丰年虾无节幼虫个数。n为孵化出的丰年虾无节幼虫平均数。N为丰年虾总数目。1.4 数据处理 采用Pad Prism6作图，Spss软件分析数据。用正交试验软件设计正交试验进行数据分析，试验数据均以“Mean±SD”表示。

2 结果

2.1 温度对丰年虾孵化率的影响 温度为24～28℃时，丰年虾孵化率随温度升高而升高；温度为28～32℃时随温度升高而下降。当温度为28℃时孵化率最高，为（73±5.9）%。与温度为28℃比较，其他各组孵化率均显著降低，差异极显著。

图1 不同温度对丰年虾孵化率的影响

2.2 pH对丰年虾孵化率的影响 pH为7.0～9.5时，丰年虾孵化率随pH的升高而升高；pH为9.5～10.0时则随pH升高而下降。当pH为9.5时孵化率最高，为（87±7.5）%。与pH为9.5比较，各个pH下显著性标记见图2。

图2 不同pH值对丰年虾孵化率的影响

2.3 盐度对丰年虾孵化率的影响 盐度为5‰～10‰时，丰年虾孵化率随盐度升高而升高；盐度为10‰～35‰时则随盐度升高而下降。当盐度为10‰时孵化率最高，为（86±3.8）%。与盐度为10‰比较，各个pH下孵化率见图3。

图3 不同盐度对丰年虾孵化率的影响

2.4 孵化时间对丰年虾孵化率的影响 时间为20～22 h时，丰年虾孵化率随时间升高而升高；时间为22～28 h时则随盐度升高而下降。当时间为22 h时孵化率最高，为（85±4）%。与时间为22 h相比，其他各组孵化率均显著降低，差异极显著。

图4 不同时间对丰年虾孵化率的影响

2.5 正交试验结果 在丰年虾孵化试验中，8号试验得到孵化率最大，为（85±5）%，此时四因素分别为温度30℃、pH为9.5、盐度为5‰、孵化时间为24 h。由表2可知，影响孵化率因素的主次顺序依次为温度和盐度、时间、pH；温度最佳水平为三水平，其他因素最佳水平均为二水平，此条件的试验方案在正交表的9次试验中并没有出现。通过做补充试验结果发现，丰年虾孵化率达（89±4）%，大于正交试验结果，说明利用正交试验优化丰年虾孵化方法有效可行。生产中为了得到最大孵化率，主要影响因素应取最佳水平，而次要因素可根据成本、时间、收益等方面的统筹考虑选取适当的水平。

表1 四因素三水平正交试验设计方案

表2 四因素三水平试验结果

3 讨论

3.1 温度 温度是影响丰年虾孵化的重要因素之一，不仅影响其孵化率，而且对其孵化时间、存活率也存在影响。已有文献报道（曾宪英等，2004），在0～35℃卤虫卵（丰年虾）均能进行生长发育。试验结果表明，本试验批次的丰年虾孵化的最适温度为30℃，这与潘正军等（2007）、刘凤岐等（2001）的研究结果存在差异。推测可能是丰年虾品系之间的差异。

3.2 pH pH对丰年虾孵化率存在一定影响，主要是通过影响丰年虾体内的孵化酶活性影响丰年虾的孵化率。有研究报道，pH为8～9时，丰年虾孵化酶活性最强（曾宪英等，2014）。酸性水质通常不利于虾壳脱落，因此孵化率较低。刘爱英等（2001）研究表明，pH为7.5～9.5对卤虫孵化率影响较大。本试验批次的丰年虾孵化最适pH为9.5。可能是因为在实际孵化过程中，随着孵化出的丰年虾幼虫增多，水体pH逐渐下降，孵化时所调pH略高于孵化酶的最适pH，有利于对水体起调节作用，稳定pH，提高孵化率。在实际生产中，需要对当地实际水体的pH进行考察，如果孵化所需要的pH存在差异，则可以跟据当地实际情况调节pH，以提高孵化率。

3.3 盐度 丰年虾孵化过程中，盐度的影响较大。在实际生产中，丰年虾对盐度的耐受性较强（潘正军等，2017），但在高盐或低盐的环境下，丰年虾孵化率会下降。盐度主要是通过改变环境中的渗透压对水产动物产生影响（Clegg等，2002；Dana等1986），当环境中渗透压超出了其调节范围，导致孵化率降低（杜学芳，2013），或者是影响丰年虾体内血红蛋白的正常结构（Trotman等，2018），使得丰年虾细胞呼吸异常，降低孵化率。丰年虾孵化盐度的耐受范围可能与丰年虾种群分布（Castro等，2000）、地区（Velasco等，2018）等有关。本试验批次的丰年虾孵化的最适盐度为10‰。在实际生产过程中需要进行实地考察，如果实际盐度与水产动物生活盐度相差较大则应对孵化场盐度进行适当调整，提高孵化率。

3.4 孵化时间 孵化时间对丰年虾孵化率具有一定影响。在实际生产过程中，孵化时间主要和其他因素共同影响丰年虾孵化率。有研究报道（刘爱英等，2000），当孵化时间为30 h，综合考虑其他因素得出丰年虾孵化率较高。本试验批次的丰年虾孵化的最适孵化时间为30 h，各个孵化时间之间的差异不显著。结合本试验结果，在实际生产过程中，应同时考虑孵化时间与其他孵化因素。

4 结论

综上所述，单因素试验结果表明，在一定范围内，温度、pH、盐度及孵化时间对丰年虾孵化率均存在显著性影响。根据正交结果可知，环境因素中，温度和盐度对丰年虾孵化率的影响大于pH和孵化时间，且4种因素彼此会相互影响。综合4种因素考虑，最佳条件为温度30℃、pH9.5、盐度10‰、孵化时间22 h。在实际生产中可以首先考虑温度和盐度两个因素，再结合当地实际情况包括孵化地的酸碱性、昼夜温差变化等进行孵化条件的调整，从而获得最高孵化率。