绵羊白细胞内的慢病毒cDNA gag基因的PCR检测

阿依努尔·亚森

摘要：在对绵羊白细胞中的慢病毒Cdna gag基因进行检验时，通过PCG检测技术的应用还能够起到良好的检测效果，对于该病毒的防治以及促进我国养殖业的发展也有着一定的积极意义。

关键词：绵羊白细胞;慢病毒;PCR

中图分类号：S585.26

文献标识码：B

doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2018.10.003

0 引言

绵羊慢病毒会直接侵害中枢神经系统，导致脑膜脑炎等疾病的发生，并有着消瘦、呼吸困难以及淋巴滤泡性间质性肺炎等临床症状。其不同株尽管存在有一定的变异性，但是依旧存在有较高的同源性。通过PCR技术的应用能够对绵羊外周血白细胞基因组中的OPP前病毒cDNAgag基因片段进行扩增整合，借此来获得良好的OPPV检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与血液样品

本次研究中主要选用了3株新疆拉库尔羊阳性血液以及2株新疆拉库尔羊阴性血液作为血液样品。

1.1.2 试剂

主要试剂包含有OPPV抗原以及标准OPPV阳性对照血清等。此外还需要应用到Shol限制性内切酶、Tap DNA聚合酶等。

1.2 方法

1.2.1 血清学实验

对200g凝血块离心10 min来进行血清的分离，在-20℃低温下进行存储，对5株新疆拉库尔羊的OPPV抗体进行血清检测。

1.2.2 DNA制备

在目标样品静脉抽取10 mL血，加入10 U/mL的肝素以及20 mL的淋巴细胞分离液之后，利用5000 r离心速度处理5 min。移除样品中的红细胞跟上清液，然后加入SDS使其浓度达到0.5%，在此基础上放入蛋白酶K进行10 h的孵育处理，期间震荡处理2～3次。处理完成之后加入等体积的酚进行混匀处理，然后在12000 r下离心处理10 min，通过70%乙醇洗涤1～2次，在室温条件下晾干。进行沉淀处理得到RNA酶，在4℃下进行悬浮沉淀处理5h，将制备完成后的DNA酶样品放置在-20℃低温下进行保存备用[l]。

1.2.3 进行白细胞疑似整合基因组的酶切

通过DNAman软件来对OPPV基因组进行分析处理，通过Xhol以及Ndel限制内切酶进行基因组的酶切处理，在结合了基因组酶切结果基础上进行引物的合理设置。

1.2.4

PCR产物的克隆

运用CaCl'完成DH5 α感受态细胞的制备处理工作，在pBS-T载体连接扩增片段回收产物，并进行DH5 α感受态细胞的转化处理。然后在100 mg/mL Apm的LB固体培养基上对培养后的克隆菌株进行筛选处理。

1.2.5 鉴定

首先选取3μL扩增产物，将其放置在1%琼脂糖凝胶上进行电泳跟扩增处理。在对质粒酶切进行鉴定时，先将筛选后的阳性菌培养一夜，然后通过离心株型质粒小提试剂对质粒进行提取。通过扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，观察并照相。

2 结果

在经过诊断检测之后，GAG基因PCR、菌落PCR以及重组子酶切鉴定结果分别见图1、图2、图3。

3 讨论

OPPV是反转录病毒基因组的转录，特点为DNA中间型，因此病毒RNA也就能够通过pol基因编码中的反转录酶转录为前病毒cDNA，前病毒DNA也可以直接整合在宿主的白细胞热色提上面，并能够在RNA多聚酶的催化作用下直接转录为正链RNA，也就是由整合在白细胞内的前病毒产生新的病毒粒子。在这一病毒表现模式之中，能够让病毒处于隐蔽的循环状态中，从而躲过机体的防御系统。但是在该病毒表现机制中还给予病毒的研究工作带来了一定的便利性，研究者们不需要再进行病毒RNA的体外反转录工作，仅仅凭借PCR检测法就能够对OPPV中前病毒cDNA起到良好的检测效果，从而验证病毒的存在。Gag基因作为OPPV病毒中比较保守的基因序列.慢病毒中不同株间的gag基因核苷酸序列还保持有非常高的相似性，通过Genbank中所提供的慢病毒基因序列合成物，还能够对OPPV整合在内的白细胞中的cDNA起到良好的PCR鉴定效果，从而就该病毒的感染机制进行有效的研究。在传统的AGID检测以及ELISA检测模式中，只能够对部分感染了OPP绵羊的抗体进行检测，但是部分病羊因为自身机体因素的影响，还存在某些时期不产生抗体或者产生的抗体过弱等问题的出现，在这些传统的检测模式中也就容易导致假阴性反应的发生，给羊群的净化跟治疗也就带来的诸多的不便。通过PCR检测法来进行前病毒cDNA的检测过程中，其能够使得OPPV的检测流程变得更加的简单跟快捷，并能够实现OPP的早期准确检出[2]。

在绵羊自然感染OvLV时，病毒的复制数量跟所能够诱导的细胞数量呈正相关联系，因此说个体素质的基因型还会对绵羊的病变情况起到直接的影响，这也就使得病程在不同阶段或者不同的绵羊个体数量在整合过程中，其整合的程度跟难度也存在有非常大的差异性。为了进行模板量的合理获取，要求研究人员在进行PCR检测之前，通过DNAman计算机软件进行核实的限制内切酶计算，然后在不影响研究前提下切开整个基因组。此外血液量对于研究结果也会造成比较明显的影响，因此在实验过程中还需要采取10 mL的血液量作为研究，并将3 mL的血液量作为对照。研究结果表明3 mL的血液量无法通过PCR扩增出特异的条带，因此说明在PCR检测过程中血液多少也是一项限制条素，通过10 mL血样进行研究时还能够促使研究结果的准确性得到大幅度的提升。在该研究中所采用的3只阳性羊中都是在发生了病毒血症的情况下进行采血的，这种采血模式还能够促使慢病毒前DNA的整合数量得到大幅度的提升，有利于该实验的顺利进行[3]。

在具体的操作过程之中，本次研究采用了降落PCR法来进行检测操作，这样一方面能够提高产物的产量，另一方面还能够促使PCR特异性得到大幅度的提升，从而使得目的基因得到准确的检测。此外在本次研究中还采用了38个循环数来进行检测，目的在于提高產物的产量。在相同条件下采用30个循环作为对照组，研究结果表明30个循环跟38个循环之间还存在有比较大的差异性，跟模板量低也有着直接的关系。当模板量比较低时，会导致PCR的初期产物量无法呈现出系数增长的情况，只能够线性增加，而到了PCR后期之后才会呈现出系数增加的情况。

近年来我国的绵羊养殖行业得到了迅速的发展，对于我国国民经济的增长也起到了良好的促进作用。但是在绵羊养殖过程中还容易受到病毒的影响，也就容易导致一系列疫病的发生，从而造成巨大的经济损失。这也就要求各研究人员能够加强对绵羊白细胞内慢病毒cDNA gag基因的检测工作，在此基础上进行病毒防治模式的合理选择。该研究中发现通过PCR检测技术能够对绵羊白细胞内的慢病毒cDNA gag基因起到良好的检测效果，对于促进我国绵羊养殖业的进一步发展也有着一定的积极意义。因此各研究人员需要加强对该方面的研究力度，对现有的绵羊疫病防治措施进行不断的优化完善，帮助养殖人员获得良好的经济效益。

参考文献

[1]滑留帅，王璟，陈付英，等，GDF9慢病毒载体的构建及其在山羊原代成纤维细胞中的稳定表达[J].中国畜牧兽医，2017（9）：2566-2572.

[2]刘腾，董丹丹，张莉，等永生化绵羊肺成纤维细胞系的构建及鉴定[J].中国动物传染病学报，2018 （2）：54-58.

[3] 黄玉，蔡蓓，王小龙，等.通过CRISPR/Cas9技术创制基因编辑山羊和绵羊模型[J]中国畜牧杂志，2017（11）：1-4.