姜黄素对高糖培养下大鼠神经胶质瘤细胞C6中p53、Siah—1和突触素蛋白表达的影响

刘晓惠 赵延欣 刘学源

中圖分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）23-3178-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.03

摘 要 目的：体外研究姜黄素对高糖培养下大鼠神经胶质瘤细胞C6中抑癌基因p53、E3泛素连接酶Siah-1和认知相关蛋白突触素（Synaptophysin）表达的影响。方法：采用CCK-8法检测10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L姜黄素在高糖培养下作用C6细胞24、48 h后的细胞存活率。采用Western blot法和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT- PCR）法检测作用24 h后正常对照组（无任何处理）、高糖培养组和姜黄素低、高浓度组（高糖+10、30 μmol/L姜黄素）细胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白及mRNA的表达情况；另同法检测高糖培养下小干扰RNA（siRNA）沉默C6细胞中p53基因后对Siah-1蛋白及mRNA表达的影响。结果：姜黄素在10～40 μmol/L浓度范围内对C6细胞存活率无明显影响，大于40 μmol/L浓度后呈浓度依赖性降低细胞存活率。与正常对照组比较，高糖培养组C6细胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表达增强，Synaptophysin蛋白及mRNA表达减弱，差异均有统计学意义（P<0.05）；与高糖培养组比较，姜黄素低、高浓度组C6细胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表达减弱，Synaptophysin蛋白及mRNA表达增强，差异均有统计学意义（P<0.05）。高糖培养下，沉默p53基因后的C6细胞中Siah-1蛋白及mRNA表达均明显减弱（P<0.05）。结论：高糖条件下，姜黄素可通过下调C6细胞中p53、Siah-1表达，进而上调Synaptophysin表达。

关键词 姜黄素；高糖；p53；大鼠神经胶质瘤细胞C6；突触素

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of curcumin on the expression of tumor suppressor gene p53， E3 ligase Siah-1 and cognitive associated protein Synaptophysin in glioma cells C6 of rats cultured in high glucose. METHODS： CCK-8 assay was used to detect survival rate of C6 cells after treated with 10， 20， 30， 40， 50， 60， 70， 80， 90， 100 μmol/L curcumin for 24， 48 h under high glucose environment. Western blot method and RT-PCR method were adopted to detect the protein and mRNA expressions of p53， Siah-1 and Synaptophysin in C6 cells of normal control group （without any treatment）， high glucose treatment group， curcumin low-concentration and high-concentration groups （high glucose+10， 30 μmol/L curcumin） after cultured for 24 h. Same method was used to determine the effects of P53 gene of C6 cells on protein and mRNA expression of Siah-1 after transfected with siRNA under high glucose environment. RESULTS： Curcumin had no significant effect on the survival rate of C6 cells in the range of 10-40 μmol/L. The survival rate of C6 cells decreased significantly in a concentration-dependent manner when the concentration of curcumin was higher than 40 μmol/L. Compared with normal control group， the protein and mRNA expressions of p53 and Siah-1 in C6 cells were enhanced in high glucose treatment group， while the protein and mRNA expressions of Synaptophysin were decreased， with statistical significance （P<0.05）. Compared with high glucose treatment group， the protein and mRNA expressions of p53 and Siah-1 in C6 cells were decreased in curcumin low-concentration and high-concentration groups， while the protein and mRNA expressions of Synaptophysin were enhanced， with statistical significance （P<0.05）. Under treated with high glucose， the protein and mRNA expressions of Siah-1 in C6 cells were decreased significantly after silencing p53 gene （P<0.05）. CONCLUSIONS： Under high glucose environment， curcumin can up-regulate the expression of Synaptophysin in C6 cells by down-regulating the expression of p53 and Siah-1.

KEYWORDS Curcumin； High glucose； p53； Glioma cells C6 of rats； Synaptophysin

姜黄素（Curcumin）是一种相对分子量较小的酚类化合物，提取于姜科黄属植物的根茎，是疏肝药物郁金、姜黄、莪术中的主要活性成分。姜黄素具有抗肿瘤、抗炎、降血脂、降血糖的功效[1]，同时由于姜黄素含有阿魏酸钠的活性成分，而后者在临床上具有改善脑微循环、清除氧自由基、抗凋亡等作用，并且毒副作用小[2]，具有巨大的临床应用潜力。

糖尿病是认知功能障碍发生的独立危险因素之一，其与认知功能障碍的发展有关。据报道，在65岁以上的住院患者中，约有26%患有糖尿病[3]。流行病学研究[4-5]和生物学证据[6-8]支持老年糖尿病患者更容易患各种类型的痴呆症[9]。同时动物实验也表明，糖尿病可明显减少海马苔藓纤维末梢和突触小泡的数量，导致实验动物的认知功能下降[10]。本研究将以大鼠的神经胶质瘤细胞C6为研究对象，通过体外模拟高糖环境重点探究不同浓度姜黄素对C6细胞中抑癌基因p53、E3泛素连接酶Siah-1和突触素（Synaptophysin）表达的影响，以期为改善糖尿病患者的认识功能障碍提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Genesys 10型紫外分光光度计、BB15型CO2培养箱（美国Thermo 公司）；Microfuge 20R型高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；TE22型蛋白转膜系统（美国GE公司）；聚丙烯酰胺垂直电泳系统（德国Biometra公司）；Elx800型酶联免疫检测仪（美国Bio-Tek 公司）；Licor Odyssey型双色红外荧光成像系统（美国Li-Cor公司）；2720型聚合酶链式反应仪（美国ABI公司）。

1.2 药品与试剂

姜黄素对照品（货号：458-37-7，纯度：98%）、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA）均购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素均购自美国Gibco公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒（日本Dojindo公司）；实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒和PrimeScript RT reagent Kit逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司）；KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix试剂盒（北京普凯瑞生物科技有限公司）；兔抗Synaptophysin单克隆抗体（货号：ab52636）、小鼠抗β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体 （货号：ab6276）、山羊抗Siah-1多克隆抗体（货号：ab131442）和兔抗p53多克隆抗体（货号：sc-5505）均购自美国Abcam公司；抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗体（美国Li-Cor公司）；磷酸酶抑制剂PhosStop（美国Sigma公司，货号：P0044，纯度：98%）、RIPA裂解液、5×蛋白上样缓冲液、20×磷酸盐缓冲溶液（PBS）、苯甲基磺酰氟 （PMSF）均购自碧云天生物技术有限公司；Tris缓冲液、甘氨酸、脱脂奶粉、无水乙醇、甲醇均购自上海生工生物有限公司；小干扰RNA（siRNA）委托上海领科生物有限公司构建完成。

1.3 细胞

大鼠神经胶质瘤细胞C6购于中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所。

2 方法

2.1 细胞培养、分组与给药

取C6细胞，以含1%双抗（青霉素、链霉素）、10%FBS、25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养，设为正常对照组；以含1%双抗（青霉素、链霉素）、10%FBS、50 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养，设为高糖培养组；取10 mg姜黄素溶于2.714 5 mL DMSO中得到浓度为10 mmol/L的母液，用培养基稀释，加入到高糖培养3 d后的细胞培养皿中，使姜黄素终浓度分别达到10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L，分别作用24、48 h，设为姜黄素处理组。

2.2 CCK-8法检测细胞存活率

按CCK-8细胞活性检测试剂盒操作方法，检测“2.1”项下不同浓度姜黄素处理组作用24、48 h后细胞的存活率，根据结果筛选出不影响细胞存活率的姜黄素浓度和作用时间。细胞存活率（%）=[给药组吸光度（OD值）-空白组OD值]/（对照组OD值-空白组OD值）×100%，其中对照组中不加姜黄素，空白组中不加姜黄素和C6细胞。

2.3 Western blot法检测细胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白表达

将10 μL PMSF 加入至1 mL RIPA裂解液中配制成蛋白裂解液，分別裂解抽提“2.1”项下正常对照组、高糖培养组和姜黄素低、高浓度组（10、30 μmol/L）作用24 h后细胞中的总蛋白，以二喹啉甲酸（BCA）试剂盒对蛋白浓度进行定量，得到不同样品的蛋白浓度后按照1 ∶ 6的比例加入6×上样缓冲液，100 ℃变性5 min，-20 ℃冰箱保存备用。按照总蛋白量为40 μg计算上样量，用移液枪将适量蛋白样品加入上样孔，成功上样后将电泳仪调至恒压80 V，待溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，电泳仪调至恒压120 V，至溴酚蓝指示剂到凝胶底部，转膜，置于一抗孵育液[小鼠抗β-actin单克隆抗体（1 ∶ 1 000）、山羊抗Siah-1多克隆抗体（1 ∶ 500）、兔抗p53多克隆抗体（1 ∶ 1 000）、兔抗Synaptophysin单克隆抗体 （1 ∶ 500）]中4 ℃孵育过夜，再置于兔抗IgG（1 ∶ 1 000）孵育液中4 ℃下孵育1 h，显色曝光后分析条带灰度值，以目标条带与内参β-actin条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。

2.4 RT-PCR法检测细胞中p53、Siah-1、Synaptophysin mRNA表达

采用Trizol法分别提取正常对照组、高糖培养组、姜黄素处理组（10、30 μmol/L）作用24 h后细胞的总RNA，将总RNA沉淀5～10 min，溶于20 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）水中。取溶解后的RNA 1 μL用DEPC水稀释200倍后，紫外分光光度计测定其260、280 nm波长处的OD值，并计算OD260/OD280值，若OD260/OD280值在1.8～2.0之间表明满足试验要求。将总RNA放于-80 ℃冰箱内保存备用。采用 PrimeScript RT reagent Kit逆转录试剂盒，将提取的RNA逆转录为cDNA，采用KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix试剂盒，将cDNA稀释10倍后进行RT-PCR检测，反应体系按说明书操作。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共进行 40个循环，结束后以mRNA的实时荧光强度的变化值为纵坐标绘制溶解曲线，最终数据以2-ΔΔct进行分析。ΔΔct=Δct（试验样品）-Δct（基准样品）；Δct（试验样品）=ct（试验组目的基因数值）-ct（试验组内参基因数值）；Δct（基准样品）=ct（对照组目的基因数值）-ct（对照组内参基因数值）。按照引物设计的原则，应用Primer Premier 5.0 软件，设计RT-PCR引物序列，该引物生成委托上海生工生物技术有限公司完成，引物序列见表1。

2.5 沉默p53对Siah-1的影响

试验分为正常对照组、高糖培养组、正常siRNA干扰组和高糖siRNA干扰组。细胞培养方法同“2.1”；siRNA沉默p53基因方法：取对数生长期C6细胞，胰酶消化后接种于6孔板中，接种时细胞密度为2.5×104 cm-2，在细胞培养达到30%～50%汇合度时行siRNA转染，沉默p53基因。按Western blot法和RT-PCR法分别检测3组细胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表达。

2.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计处理。计量资料用x±s表示，数据采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。所有实验均重复至少3次。

3 结果

3.1 细胞存活率

10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L姜黄素作用24 h后C6细胞存活率分别为（98.120±0.69）%、（97.144±2.35）%、（92.876±2.08）%、（92.530±1.57）%、（84.636±0.54）%、（66.587±1.38）%、（56.740±1.75）%、（23. 521±1.59）%、（3.046±1.18）%、（2.879±0.23）%，经单因素方差分析发现P<0.05，表明作用24 h时姜黄素浓度对C6细胞存活率有影响；作用48 h后C6细胞存活率分别为（91.381±1.03）%、（86.739±2.82）%、（85.478± 2.34）%、（77.318±3.66）%、（62.085±0.71）%、（58.214± 1.26）%、（43.619±3.65）%、（19.104±2.85）%、（6.067±4.63）%、（2.100±0.251）%，经单因素方差分析发现P<0.05，表明作用48 h时姜黄素浓度对C6细胞存活率有影响。上述结果可以看出，姜黄素浓度为10～40 μmol/L时不会显著降低C6细胞存活率，浓度大于40 μmol/L时，随着作用浓度的升高，C6细胞存活率随之降低，呈剂量依赖性；同时药物作用时间24 h优于48 h。不同浓度姜黄素对细胞存活率的影响见图1。

3.2 细胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白表达

与正常对照组比较，高糖培養组细胞中p53、Siah-1蛋白表达明显增强，Synaptophysin蛋白表达明显减弱，差异均有统计学意义（P<0.05）。与高糖培养组比较，姜黄素低、高浓度组细胞中p53、Siah-1蛋白表达明显减弱，Synaptophysin蛋白表达明显增强，差异均有统计学意义（P<0.05）。各组细胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白表达的电泳图见图2，测定结果见图3。

3.3 细胞中p53、Siah-1、Synaptophysin mRNA表达

与正常对照组比较，高糖培养组细胞中p53、Siah-1 mRNA表达明显增强，Synaptophysin mRNA表达明显减弱，差异均有统计学意义（P<0.05）。与高糖培养组比较，姜黄素低、高浓度组细胞中p53、Siah-1 mRNA表达明显减弱，Synaptophysin mRNA表达明显增强，差异均有统计学意义（P<0.05）。各组细胞中p53、Siah-1、Synaptophysin mRNA表达的测定结果见图4。

3.4 siRNA沉默p53基因后对Siah-1的影响

3.4.1 正常培养 与正常对照组比较，正常siRNA干扰组细胞中p53 蛋白和mRNA表达均明显减弱，差异均有统计学意义（P<0.05），提示siRNA干扰组成功沉默p53基因。正常条件下siRNA干扰后细胞中p53蛋白表达的电泳图见图5，p53蛋白及mRNA表达的测定结果见图6。

3.4.2 高糖培养 与正常对照组比较，高糖培养组细胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表达均明显增强（P<0.05）。与高糖培养组比较，高糖siRNA干扰组细胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表达均明显减弱（P<0.05）。提示沉默p53基因可明显抑制高糖培养下C6细胞中Siah-1蛋白及mRNA表达的增强。高糖条件下siRNA干扰后细胞中p53、Siah-1蛋白表达的电泳图见图7，p53、Siah-1蛋白及mRNA表达的测定结果见图8。

4 讨论

Synaptophysin是突触小泡中的主要蛋白質，在整个大脑的神经元和神经内分泌细胞中普遍存在，并被证明与认知功能密切相关[11]。突触传递过程是认知功能表达的重要环节，Synaptophysin作为突触的特异性标记，已有研究证实其参与了神经递质释放、突触可塑性、突触小泡形成以及再利用的过程，涉及学习、记忆等认知方面[12-13]，同时在糖尿病认知功能障碍的动物模型中可以观察Synaptophysin的表达下降[14]。研究表明，Siah-1是降解Synaptophysin的主要蛋白酶，在神经元中主要通过泛素-蛋白酶体途径进行降解[15]。

在本研究中，笔者体外模拟高血糖症模型培养大鼠的神经胶质瘤细胞C6，探讨高糖条件下姜黄素对认知保护蛋白Synaptophysin的调节作用，并探讨了其相关作用机制。笔者将姜黄素配制成10～100 μmol/L的溶液，分别加入到高糖培养3 d后的C6细胞模型中，分别作用24、48 h，采用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测细胞活性。结果显示，姜黄素浓度为10～40 μmol/L时不会显著降低细胞存活率，同时药物作用时间24 h优于48 h，所以后续试验选取了10、30 μmol/L作为姜黄素的实验浓度，24 h作为作用时间。这一结果说明姜黄素的药物浓度在较小的一定范围内不会对细胞活性造成损伤，但超过一定的浓度范围，会显著降低细胞存活率，对细胞活性造成损伤。相同药物浓度下作用48 h后的细胞存活率依次低于作用24 h的细胞存活率，表明药物作用时间越长对细胞存活率损伤越大。通过对p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白和mRNA表达水平的检测结果提示，高糖培养3 d后细胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表达均明显增强，同时Synaptophysin蛋白和mRNA表达均明显减弱；之后姜黄素作用24 h后细胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表达均明显减弱，同时Synaptophysin蛋白和mRNA表达均明显增强。为了进一步研究姜黄素是否是通过调控p53、Siah-1进而上调Synaptophysin的，本文还构建了p53基因沉默C6细胞，结果显示，高糖siRNA干扰组细胞中Siah-1基因也随之下调，提示高糖条件诱导沉默p53可抑制Siah-1上调，进而介导泛素化降解Synaptophysin，使Synaptophysin表达上调。

综上所述，高糖条件下，姜黄素可通过下调C6细胞中p53、Siah-1表达，进而上调Synaptophysin表达。

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（收稿日期：2018-05-23 修回日期：2018-10-17）

（編辑：邹丽娟）