盐霉素纳米结构脂质载体的制备及处方优化

韩翠艳　金珊珊　王晓丽　简白羽　隋小宇　曹立新

中圖分类号 R943 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）03-0317-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.07

摘 要 目的：制备盐霉素纳米结构脂质载体（Sal-NLCs）并优化处方。方法：采用熔融乳化-低温固化法制备Sal-NLCs。采用星点设计-响应面法，以粒径、Zeta电位、包封率、载药量为评价指标，优化处方中Sal用量、油相中固态脂质双硬脂酸甘油酯与液态脂质辛癸酸甘油酯的质量比、表面活性剂聚氧乙烯35蓖麻油（EL）与聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯（HS15）的质量比及聚氧乙烯（40）硬脂酸酯（P40）的用量。考察所制Sal-NLCs的外观形态、粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位、包封率、载药量和体外释药机制。结果：最优处方为Sal 0.86 mg、双硬脂酸甘油酯40.70 mg、辛癸酸甘油酯11.30 mg、EL 44.05 mg，HS15 7.95 mg、P40 3.8 mg；所制Sal-NLCs呈类圆形、分布均匀，粒径为（81.81±2.60）nm、PDI为0.183±0.042、Zeta电位为（-24.9±3.4） mV、包封率为（94.35±1.50）%、载药量为（1.47±0.04）%（n=5），24 h内累积释放度达到（99.81±3.90）%（n=3），释放行为符合Higuchi模型，其中粒径、Zeta电位、包封率、载药量与模型预测值的相对误差均小于4%。结论：按优化处方成功制得具有缓释效果的Sal-NLCs，且质量达到预期标准。

关键词 盐霉素；纳米结构脂质载体；熔融乳化-低温固化法；星点设计-响应面法；处方优化

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Salinomycin nanostructured lipid carriers（Sal-NLCs） and optimize its formulation. METHODS： Sal-NLCs was prepared by emulsion evaporation-low temperature solidification method. Using particle size， Zeta potential， encapsulation efficiency and drug loading as evaluation indexes， central composite design-response surface methodology was used to optimize the amount of Sal， the ratio of solid lipid glyceryl bisstearate to liquid lipid glyceryl octanoate in oil phase， ratio of surface active agent polyoxyethylene 35 castor oil （EL） to polyethylene glycol-15-hydroxy stearate （HS 15）， the amount of polyoxyethylene （40） stearate （P40）. The morphology， particle size， polydispersity index （PDI）， Zeta potential， encapsulation efficiency， drug loading and in vitro release mechanism of Sal-NLCs were investigated. RESULTS： The optimal prescription was as follows as Sal 0.86 mg， glyceryl bisstearate 40.70 mg， glyceryl octanoate 11.30 mg， EL 44.05 mg， HS15 7.95 mg， P40 3.8 mg. Prepared Sal-NLCs was round-like and dispersed evenly. The particle size， PDI， Zeta potential， encapsulation efficiency and drug loading of prepared Sal-NLCs were（81.81±2.60） nm， 0.183±0.042，（-24.9±3.4） mV，（94.35±1.50）% and （1.47±0.04）% （n=5）， respectively. 24 h accumulative release rate was （99.81±3.90）% （n=3）. Drug release behavior was in line with Higuchi model， and relative error of particle size， Zeta-potential， encapsulation efficiency and drug loading to predicted value of model were all lower than 4%. CONCLUSIONS： Sal-NLCs with sustained-release effect is prepared successfully according to optimized formulation， and its quality meets the expected standard.

KEYWORDS Salinomycin； Nanostructured lipid carriers； Emulsion evaporation-low temperature solidification method； Central composite design-response surface methodology； Formulation optimization

盐霉素（Salinomycin，Sal）是一种可以有效杀伤肿瘤干细胞的聚醚酯类跨膜离子载体抗生素，几乎不溶于水[1]，且组织选择性差，因此，如何改善Sal的溶解性、提高其靶向性、减小其毒副作用是一个亟待解决的问题。固体脂质体纳米粒是以固态的天然或合成的类脂为载体的脂质纳米粒，在类脂纳米粒中引入液态的脂质材料后，可形成纳米结构脂质载体（Nanostructrued lipid carries，NLCs）。NLCs可以改善药物的溶解度，具有生物相容性好、存储稳定、不易发生药物泄漏、适宜工业化大批量生产等优点，在药物缓控释、靶向、透皮、黏膜给药等领域具有广泛的应用[2-3]。为了改善Sal的溶解性，本研究将Sal制成Sal-NLCs，并采用星点设计-响应面法（CCD-RSM）进行处方优化，还考察了所制Sal-NLCs的粒径、Zeta电位、包封率、载药量等各项指标。

1 材料

1.1 仪器

Malvern Zetasizer Nano-ZS90纳米粒径电位分析仪（英国Malvern公司）；Eppendorf 5804R台式高速大容量离心机（北京博仪恒业科技发展有限公司）；HT 7700透射电子显微镜（日本日立公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）。

1.2 药品与试剂

Sal原料药（美国Cayman Chemical公司，批号：0443366-37，纯度：≥90%）；双硬脂酸甘油酯（法国Gattefosse公司）；辛癸酸甘油酯（马来西亚KLK油脂化工集团）；聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯（HS15）、聚氧乙烯35蓖麻油（EL，德国Basf公司）；聚氧乙烯（40）硬脂酸酯（P40，美国Sigma公司）；乙腈为色谱纯，其余均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 Sal含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：ODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水-四氢呋喃-磷酸（85 ∶ 10 ∶ 5 ∶ 0.1， V/V/V/V）；流速：1.5 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.1.2 专属性试验 精密称取Sal原料药适量，以甲醇为溶剂，制备成质量浓度为1 mg/mL的Sal溶液，经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。另取不含Sal的空白NLCs，经乙腈破乳后，以3 000 r/min（离心半径11.4 cm）离心20 min，取上清液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。色谱图显示，Sal的出峰时间为15.5 min，NLCs所用辅料对Sal的测定无干扰。

2.1.3 线性范围考察 精密量取Sal溶液，按一定比例制备成10、50、70、150、300、500 μg/mL系列质量浓度的标准供试液，经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得回归方程y=1 004.7x-11 554（R2=0.999 0），结果表明，Sal检测质量浓度的线性范围为10.08～504.00 μg/mL。

2.1.4 精密度与方法回收率试验 取质量浓度为50、250、450 μg/mL的Sal溶液，经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，每天进样5次考察日内精密度；每日进样1次，连续进样5 d考察日间精密度；以实测值与真实值的比值考察方法回收率。结果显示，50、250、450 μg/mL Sal溶液中Sal峰面积的日内RSD分别为2.36%、0.32%、0.18%（n=5），日间RSD分别为1.69%、0.29%、0.14%（n=3），方法回收率分别为99.89%、100.13%、101.13%（RSD=0.21%、1.00%、0.99%，n=3），均符合相关规定。

2.2 Sal-NLCs的制备

采用熔融乳化-低温固化法制备Sal-NLCs。称取处方量的Sal、双硬脂酸甘油酯及辛癸酸甘油酯，80 ℃水浴熔融，作为油相；另称取处方量表面活性剂HS15、EL和P40，溶于适量纯化水中，作为水相，并加热至相同温度。在恒温水浴磁力搅拌下，将油相缓慢加入水相中，继续搅拌15 min后，迅速转移至冰水浴中固化，经0.8、0.45、0.22 μm微孔滤膜依次过滤后，即得Sal-NLCs。

2.3 评价指标的测定

2.3.1 包封率和载药量 采用超滤离心法测定包封率和载药量[4]。取Sal-NLCs溶液置于超滤离心管（截留分子量為10 kDa）中，10 000 r/min（离心半径11.4 cm）离心40 min，收集下清液，经甲醇稀释后，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，代入回归方程计算Sal含量，即游离药物含量W游离。取Sal-NLCs溶液，置于离心管中，经乙腈破乳后，3 000 r/min（离心半径11.4 cm）离心20 min，取上清液，进样测定，计算Sal含量，即总药物含量W总。按照下述公式计算Sal-NLCs的包封率（%）和载药量（%），包封率=（W总-W游离）/W总×100%，载药量=（W总-W游离）/W脂质×100%，式中W脂质为处方中液态脂质和固态脂质的总量[5]。

2.3.2 粒径与Zeta电位 将Sal-NLCs用纯化水稀释50倍后，置于纳米粒径电位分析仪中测定粒径、Zeta电位。

2.4 优化处方

2.4.1 星点试验 前期单因素试验结果表明，对Sal-NLCs质量有显著影响的是油相双硬脂酸甘油酯-辛癸酸甘油酯的比例、表面活性剂EL-HS15的比例和P40用量，其中脂质最佳总量为52.00 mg，EL和HS15最佳总量为52.00 mg。因此，选择以粒径（Y1）、Zeta电位（Y2）、包封率（Y3）、载药量（Y4）为因变量，Sal用量（X1）、双硬脂酸甘油酯-辛癸酸甘油酯用量比（X2）、EL-HS15用量比（X3）、P40用量（X4）为自变量，在粒径<200 nm、Zeta电位绝对值>20 mV、包封率>70%、载药量>1%的前提下，采用Design-Expert 8.0软件，设计星点试验方案[5-8]，自变量与水平见表1，星点试验设计与结果见表2。

2.4.2 模型拟合 采用Design-Expert 8.0软件，根据拟合优度（R）和置信度（P）对表2的数据结果进行数学模型预测，多元线性拟合，评价指标与各因素的函数关系如下：

Y1=110.75+2.26X1-16.86X2-1.15X3+24.47X4-1.44X1X2-2.27X1X3-2.95X1X4-0.97X2X3+2.92X2X4+0.86X3X4-6.86X12+1.02X22-3.42X32+4.95X42+0.95X1X2X3+1.65X1X2X4+2.17X1X3X4-2.23X2X3X4+4.72X12X2+1.40X12X3-26.12X12X4+1.93X1X22-0.96X1X2X3X4-14.20X12X22（R2=0.999 9，P<0.000 1）；

Y2=-27.17+0.15X1+2.00X2+0.70X3-0.50X4-0.036X1X2+0.16X1X3+0.23X1X4-0.54X2X3-0.076X2X4-0.35X3X4+0.97X12-0.058X22-0.058X32+0.52X42-0.049X1X2X3+0.011X1X2X4-0.19X1X3X4+0.036X2X3X4-1.05X12X2-3.13X12X3-1.61X12X4-0.63X1X22-0.051X1X2X3X4+4.01X12X22（R2=0.998 9，P<0.000 1）；

Y3=35.05-3.60X1+8.21X2-2.54X3-16.10X4+0.78X1X2+0.88X1X3+0.95X1X4-6.28X2X3+3.32X2X4+12.55X3X4+8.26X12+8.47X22+11.10X2X3X4-3.99X12X2+1.16X12X3+13.26X12X4+2.24X1X22+0.67X1X2X3X4-7.46X12X22（R2=1.000 0，P<0.0001）；

Y4=0.65+0.13X1+0.082X2-0.002 5X3-0.23X4+0.033X1X2-0.019X1X3-0.005 625X1X4-0.077X2X3+0.033X2X4+0.18X3X4+0.12X12+0.12X22+0.16X32+0.028X42-0.004 375X1X2X3-0.017X1X2X4+0.038X1X3X4-0.077X2-0.006 875X12X2-0.014X12X3+0.22X12X4-0.014X1X22-0.012X1X2X3X4-0.083X12X22（R2=1.000 0，P<0.000 1）。

上述多元线性拟合结果显示，R2均大于0.9，P均小于0.01，数学模型拟合良好，预测数据可取[9-10]。

2.4.3 响应面优化 自变量与因变量的响应面图见图1（仅列出有显著相关关系的图，余图略）。

由响应面图可知，X1、X2、X3、X4对Y1、Y2、Y4均影响显著，而只有X1和X2对Y3影响显著。综合考虑，Sal-NLCs最优处方中X1为0.86 mg，X2为3.6，X3为5.54，X4为3.8 mg，即Sal 0.86 mg，双硬脂酸甘油酯40.70 mg，辛癸酸甘油酯11.30 mg，HS15 7.95 mg，EL 44.05 mg，P40 3.8 mg。

2.4.4 处方验证 按照最优处方平行制备Sal-NLCs溶液5份，检测其粒径、Zeta电位、包封率和载药量，结果见表3。

由表3结果可知，各指标测定结果与预测值的相对误差均小于4.0%，说明预测得到的最优处方可靠。

2.5 Sal-NLCs制剂学性质考察

2.5.1 外观形态 所制Sal-NLCs外观澄清，呈淡蓝色乳光。取所制Sal-NLCs，经纯化水稀释10倍后，滴加至铜网上，2%磷钨酸染液染色，静置数分钟，干燥后转移至透射电镜下观察其形态。结果表明，Sal-NLCs呈类圆形，均匀分布，无可见颗粒，Sal-NLCs透射电镜图见图2。

2.5.2 粒径与Zeta电位 检测所制5批次的Sal-NLCs的粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位，结果分别为（81.81±2.60） nm、（0.183±0.042）、（-24.9±3.4） mV（n=5）。粒徑与Zeta电位分布图见图3。

2.5.3 包封率与载药量 检测所制5批次的Sal-NLCs的包封率和载药量，结果分别为（94.35±1.50）%和（1.47±0.04）%（n=5）。

2.5.4 体外释药行为 采用透析袋法对Sal-NLCs的体外释药行为进行考察。为满足漏槽条件，使体系中药物终浓度小于其饱和浓度的10%，在释放介质磷酸盐缓冲液（PBS）中加入了20%乙醇和6%十二烷基硫酸钠（SDS）。具体操作为：取Sal-NLCs溶液1.0 mL于预先活化好的透析袋中，并置于50 mL释放介质（pH 7.4）中。在（37±2） ℃、200 r/min条件下恒速搅拌，分别于0、1、2、3、4、7、11、13、23、24 h取2.5 mL，同时补加相同体积的释放介质。将2.5 mL样品置于旋转蒸发仪中进行浓缩，1.0 mL 50%甲醇水溶液复溶，经0.45 μm的微孔滤膜处理后，测定药物含量，绘制释放曲线，以时间为横坐标（x，h）累积释放度为纵坐标（y，%）拟合体外释放模型。Sal-NLCs体外释药曲线见图4，体外释药模型拟合结果见表4。

由图4和表4结果可知，Sal-NLCs的释放初期存在突释现象，可能是因为溶液中部分游离以及少量吸附在NLCs表面的药物存在所致。24 h内，Sal-NLCs累积释药（99.81±3.90）%，体外释药行为符合Higuchi模型，具有缓释效果。

3 讨论

采用超滤离心法测定药物包封率时，发现下清液中的药物浓度远远高于其在纯化水中的溶解度，考虑可能是处方中的乳化剂对Sal具有增溶作用所致。因此，在考察超滤膜对盐霉素是否有吸附作用时，在游离药物溶液中加入了50%甲醇，用以改善盐霉素的溶解性，且超滤膜对该溶剂耐受。

在制备Sal-NLCs时，为实现最大药物包载量，分别考察了盐霉素在不同脂质材料中的溶解度。结果在固态脂质材料中双硬脂酸甘油酯>单硬脂酸甘油酯，在液态脂质材料中辛癸酸甘油酯>大豆油，因此本研究处方分别选用双硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯。本试验也考察了不同表面活性剂HS15、EL、P40、蓖麻油聚烃氧酯35、聚山梨酯80对粒径和Zeta电位的影响，结果合用两种表面活性剂使用效果强于单一的表面活性剂，其中HS15与EL合用效果最佳，同时考虑到NLCs的“隐形”效果[11-13]，加入含有聚乙二醇（PEG）结构的P40，因此最终选用3种表面活性剂。

纳米载体质量评价的主要指标是粒径、电位、包封率和载药量。有文献报道，当Zeta电位的绝对值>20 mV时，纳米粒溶液处于稳定状态[13-15]。当粒径<200 nm时，可以渗透并滞留在肿瘤部位[16]。因此，在筛选Sal-NLCs时，设定纳米粒粒径<200 nm、Zeta电位绝对值>20 mV。同时，将包封率和载药量分别设定为80%和1%以上，以期达到有效治疗浓度，避免游离Sal过多，杀伤正常细胞。

此外，笔者还研究了Sal-NLCs体外细胞试验，结果表明Sal-NLCs对CD133（一种跨膜蛋白，肿瘤干细胞标志物）阳性的肿瘤干细胞的增殖抑制率明显高于Sal，显示了更强的细胞毒性，还进一步对Sal-NLCs进行了靶向修饰，相关研究将另文发表。

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（收稿日期：2017-08-30 修回日期：2017-11-02）

（編辑：邹丽娟）