温度对烟草物质代谢的影响

逄 涛，林 茜，李 勇，师君丽，邓建华，卢秀萍

(1. 云南省烟草农业科学研究院，云南 玉溪 653100；2．玉溪师范学院，云南 玉溪 653100)

【研究意义】烟叶品质的形成是遗传因素、生态环境和栽培技术综合作用的结果[1]。在品种一定的情况下，生态条件是影响烟叶产质量的主要因素[2-3]。【前人研究进展】研究表明，在所有生态条件中，温度条件对烤烟烟叶品质的影响较大，是决定烟叶品质和产量的重要因素之一[4]。从品质来看，气温条件要求为前期较低，中期较高，成熟期以不低于20℃为宜[5-6]。许多研究结果表明，温度对烟草种子萌发特性(发芽势、发芽率、萌发时间)[7-8]、苗期光合作用[9-11]、烟株大田期生长发育(农艺性状、生物量、根系活力)[12-13]等均有重要的影响。前期研究表明，成熟期、移栽期和全生育期平均气温是影响烟叶质量的关键生态因子。对香型影响最大的前5个气候因子分别是成熟前期温度、旺长期温度、成熟后期温度、成熟中期和后期日照。【本研究切入点】至今温度对烟草生长发育的影响研究主要集中在光合作用等生理生化方面[14-16]，而温度对烟草不同生育期物质代谢影响的研究报道较少[17]。【拟解决的关键问题】为此，研究分析烟草不同生育期不同生长温度对糖类、生物碱类、类黄酮、氨基酸、有机酸以及香气物质等烟草主要代谢产物的影响，明确温度对烟草生育期和代谢产物的影响差异性，为特色优质烟叶开发提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 烟株实验处理

实验所用烟草品种为烤烟云烟87，统一播种，共60株移入盆栽，在室外环境下生长。当烟株进入团棵期时，烟株平均分配分别移入均温为21、23和25 ℃的3个人工气候室内，处理15 d后搬至室外继续生长，直至成熟，取中部叶按正常生产流程烘烤，备用。当室外生长烟株进入旺长期和成熟期时，采用与团棵期相同的处理方法，将另外60株一直在室外盆栽环境下生长的烟株平均分配至上述人工气候室中处理15 d后再搬至室外继续生长，直至成熟，烘烤，备用。

人工气候室条件：共3间，每间设有6列灯架，每列灯架配有6盏灯，光源为高压钠灯，灯架高度可调，确保第12片烟叶在整个处理期间所照射的光强为300 μmol/m2·s。设置昼夜各12 h的光周期，室内CO2浓度400×10-6。室内温度根据一天中温度变化的趋势动态变化，3间气候室日内平均温度分别设置为21、23和25 ℃。每隔1 d分别浇水1 kg/株，其他管理同大田管理一致。

1.2 样品分析

1.2.1 糖、氨基酸、有机酸等物质分析 分析方法参照烟草代谢组学分析方法[18-21]。

样品制备：将初烤后的烟叶样品粉碎，过40目，室温保存。样品提取和处理：准确称20 mg烟叶样本，加入甲醇370 μl、去离子水680 μl、甲基叔丁基醚450 μl，超声提取30 min，离心，取上清液200 μl，加入200 μl内标溶液(对羟基香豆酸，0.1 mg/mL，水溶液)，冻干，加入100 μl甲氧胺吡啶溶液(20 mg/mL))，37 ℃恒温水浴90 min，肟化保护α-酮羰基，加入80 μl MSTFA，37 ℃恒温水浴30 min，硅烷化提高样品挥发性。将反应完溶液转入气相色谱进样小瓶待分析。色谱分析条件：色谱柱DB-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，柱流量1 mL/min。程序升温条件：60 ℃保持1 min，5 ℃/min升至280 ℃，保持15 min。进样量1 μl。质谱分析条件：传输线温度为230 ℃，溶剂延迟时间为7 min，质量扫描范围为m/z 35-350，质谱数据采集速度为2 Hz。

1.2.2 生物碱类物质分析 分析方法参照烟草生物碱分析方法[22]。

准确称取烟样0.5 g于50 mL离心管中，加入5 mL 10 %的NaOH溶液，摇匀，浸泡15 min，加入20 mL含内标的萃取液，超声60 min，在离心机上5000 r/min离心5 min，取2 mL下层二氯甲烷清液过装有2 g无水硫酸钠的微孔过滤器后，用气相色谱-串联质谱仪分析。

色谱柱：BR-5MS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)；进样量：1 μl，分流比20∶1；进样口：250 ℃；程序升温：100 ℃保持3 min，7 ℃/min 升至170 ℃，100 ℃/min 升至260 ℃，保持6 min；载气：氦气，1.0 mL/min。

传输线温度230 ℃，离子源温度210 ℃；电离模式：电子轰击电离(EI)；轰击能量70 eV；灯丝电流50 μA，电子倍增器电压1200 V；碰撞气：氩气(纯度≥99.999 %)；碰撞池压力0.3 Pa；溶剂延迟时间4 min；数据采集模式：多反应离子监测模式。

1.2.3 类黄酮物质分析 分析方法参照烟草类黄酮分析方法[23]。

样品提取：称取烟叶样品10 mg，加入提取剂1 mL(甲醇∶水∶氯仿=5∶2∶2，v∶v∶v)和200 μl内标溶液(染料木苷、橙皮苷和黄豆苷元浓度均为1 μg/mL)，超声30 min，离心，取上清液转入液相色谱进样小瓶待分析。

色谱分析条件：色谱柱，Waters BEH C18 (15 cm×2.1 mm×1.7 μm)；A相水，B相乙腈，两相均添加0.1 %的甲酸和0.2 mmol/L的醋酸铵；流动相梯度，0～1 min，10% B；1～9 min, 10 % B→90 % B；9～11 min，90 % B→100 % B；11～11.1 min，100 % B→10 % B；11.1～13 min，保持10 % B；进样量2 μl，流速0.25 mL/min，柱温30 ℃。

质谱分析条件：离子源，电喷雾电离离子源；喷雾电压，-4000 V；帘气压力，40 psi；离子源温度，700 ℃；辅助气1，60 psi；辅助气2，50 psi；去簇电压，-100 V。

1.2.4 香气物质分析 分析方法参照烟草香气成分分析方法[24]。

准确称量20 g制备好的烟末样品，放入1000 mL的平底烧瓶，同时加入350 mL蒸馏水和1 mL内标溶液(20.3 μg/mL正十七烷，二氯甲烷为溶剂)。向100 mL烧瓶中加入60 mL二氯甲烷作为萃取溶剂。将1000 mL烧瓶和100 mL烧瓶分别安装到同时蒸馏萃取装置的蒸馏端和萃取端，以电热套加热装有烟末的烧瓶至沸腾，60 ℃水浴加热装有二氯甲烷的烧瓶，提取2.5 h。将提取得到的二氯甲烷溶液加入10 g无水硫酸钠进行过夜干燥。将干燥后的萃取液转移至旋转蒸发仪进行浓缩并定容至1.0 mL，并转入气相色谱进样品小瓶，以备分析。

色谱分析条件：色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温条件：50 ℃保持1 min，5 ℃/min升至160℃保持2 min，5 ℃/min升至270 ℃保持6 min；进样口温度为250 ℃；进样体积为2 μl；载气为氦气；柱流量为1.1 mL/min；分流比为20∶1。

质谱分析条件：传输线温度为230 ℃；溶剂延迟时间为1.9 min；质量扫描范围为m/z 35～350；质谱数据采集速度为5 Hz。

1.3 数据分析

色谱图去卷积和峰识别采用AMDIS V 2.7；化合物定性采用NIST MS Search 2.0，配有NIST mainlib数据库和 Wiley registry8e数据库。数据分析所用软件为SPSS 18.0，DPS 7.5。

2 结果与分析

2.1 温度对烟草糖类物质代谢的影响

糖类物质对植物的生长发育和代谢非常重要，它既是光合作用的产物，又是呼吸作用的底物，它能够为植物的生长发育提供所需的碳骨架和能量，并能增强植物的抗逆性。糖类物质的代谢是整个生物代谢的中心，连通着蛋白代谢、脂类代谢、核酸代谢及相关的次生物质代谢。糖代谢还能影响植物抗协迫环境的能力[25]。

云烟87在旺长期25 ℃处理下其糖类物质总量显著高于同一时期的其它温度处理；3个不同生育期不同温度处理下云烟87的葡萄糖和果糖含量没有显著性差异；甘露糖含量在伸根期随处理温度的升高而升高；在旺长期和成熟期25 ℃处理下相对其它处理温度其蔗糖含量分别显著升高和显著降低(图1)。

2.2 生长温度对烟草生物碱代谢的影响

生物碱是存在于自然界中的一类含氮的碱性有机化合物。以尼古丁为代表的烟草生物碱的含量直接决定烟叶的内在品质、安全性和可用性[26]。云烟87在伸根期、旺长期和成熟期生物碱总量均随温度的上升而升高，其中尼古丁含量变化与生物碱总量变化趋势一致，麦斯明和新烟碱含量在成熟期表现为随温度上升而升高，而去氢新烟碱在成熟期的含量变化趋势与麦斯明和新烟碱相反(图2)。

2.3 温度对烟草类黄酮代谢的影响

类黄酮物质是烟草中非常重要的次生代谢物。类黄酮物质已在很多植物体中被证明与植物的抗虫和抗病相关[27]。烟草中的类黄酮还是烟草中许多香味物质的重要前体物，其分解产物与烟草的香气质和香气量有关[28]。类黄酮物质对改善烟草制品的品质有着重要的作用，在烟叶烘烤、储存和燃烧过程中，类黄酮可氧化分解，能够赋予烟气以优雅的清香气味，增加香气量、提高香气质。

旺长期和成熟期生长温度对烟草类黄酮总量影响较大，云烟87类黄酮总量在旺长期随温度升高而降低、在成熟期随温度的升高而升高。芸香苷含量随温度变化的趋势与类黄酮总量的变化趋势基本一致，山奈酚-3-芸香糖苷和柚皮素-7-葡萄糖苷的含量受成熟期温度影响较大(图3)。

2.4 温度对烟草香气物质代谢的影响

烟叶挥发性香气成分是评定烟叶及其制品品质的重要指标。烟叶挥发性香气成分主要可分为叶绿素降解产物、类胡萝卜素降解产物、西柏烷类化合物、美拉德反应产物、芳香族氨基酸降解物等。这些挥发性香气成分主要包括醛酮类化合物、呋喃类化合物、吡啶类化合物、吡嗪类化合物，以及部分有机酸等。烟叶中许多挥发性香味成分可直接进入烟气, 并对烟气的香气质、香气量等产生重要影响。

RE, VG and Ma分别代表伸根期、旺长期、成熟期，下同RE, VG and Ma stand for developmental phases of root extending, vigorous growing, and mature，respectively. The same as below图1 不同生育期不同温度处理云烟87糖类物质变化情况Fig.1 Saccharides contents of Yunyan 87 with different temperatures at different growth periods

图2 不同生育期不同温度处理云烟87生物碱变化情况Fig.2 Alkaloids contents of Yunyan 87 with different temperatures at different growth periods

图3 不同生育期不同温度处理云烟87类黄酮变化情况Fig.3 Flavonoids contents of Yunyan 87 with different temperatures at different growth periods

伸根期和成熟期生长温度对香气物质总量的影响较大，香气物质总量均表现为随温度的升高而升高。伸根期受温度影响较大的化合物有苯甲醇、2-乙酰吡啶、3-羟基-2-丁酮和2，3-戊二酮，旺长期受温度影响较大的化合物有6-甲基2-庚酮、2-异丙基-5氧-己醛、2，3-戊二酮和3-羟基-2-丁酮，成熟期受温度变化影响较大的化合物有新植二烯和巨豆三烯酮(图4)。

2.5 温度对烟草氨基酸代谢的影响

氨基酸是烟草中一类重要的致香前体物质, 它们本身对烟草香味没有直接贡献，但在烟草生产和加工过程中, 会与碳水化合物发生非酶棕化反应, 生成一些对烟草的香吃味产生显著影响化合物。

伸根期温度对氨基酸总量影响较大，云烟87氨基酸总量在伸根期随温度的升高而降低；伸根期温度对脯氨酸含量影响与对氨基酸总量的影响一致；成熟期温度对缬氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、焦谷氨酸和脯氨酸的含量影响较大，成熟期25 ℃处理下云烟87缬氨酸、苯丙氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸含量均高于其他温度处理(图5)。

2.6 温度对烟草有机酸代谢的影响

烟草中的有机酸主要是指除氨基酸以外的有机酸。有机酸不仅在烟草生长过程中起着重要作用，而且对烟草及其制品的质量有重要影响，烟草中的有机酸可以增加烟气酸性，中和烟碱，使烟气更加醇和。

成熟期温度对有机酸总量影响较大，云烟87成熟期有机酸含量25 ℃处理下显著高于其它温度处理；成熟期下丙酮酸、乳酸、丙二酸、马来酸、丁二酸、富马酸、柠檬酸等含量25 ℃处理均显著高于其它温度处理；云烟87在旺长期丙酮酸、乳酸、丁二酸、富马酸等含量随处理温度升高而降低；云烟87在伸根期乳酸、柠檬酸含量随温度升高而升高(图6)。

图4 不同生育期不同温度处理云烟87香气物质变化情况Fig.4 Aroma compounds contents of Yunyan 87 with different temperatures at different growth periods

图5 不同生育期不同温度处理云烟87氨基酸变化情况Fig.5 Amino acids contents of Yunyan 87 with different temperatures at different growth periods

2.7 各生育期不同生长温度处理下主要差异性代谢物统计

综合研究结果，不同生育期生长温度对烟叶物质代谢的影响十分复杂。对不同生育期不同生长温度处理下产生的显著性差异代谢物(t检验P值小于0.01，且最大平均值与最小平均值相差两倍以上)进行统计，发现伸根期温度变化对香气物质、氨基酸、有机酸等代谢物的含量影响较大，旺长期温度变化对类黄酮、香气物质、有机酸等代谢物含量影响较大，成熟期温度变化对类黄酮、香气物质、氨基酸、有机酸等代谢物含量影响较大(表1)。从筛选出的显著性差异代谢物数量来看，伸根期有11个，旺长期有17个，成熟期有15个。伸根期、旺长期和成熟期显著性差异代谢物的平均变化倍率分别为2.6、3.7和3.2倍。综合筛选出的差异代谢物数量和代谢物变化倍率，发现旺长期温度变化对代谢物影响最大，其次是成熟期和伸根期。

3 讨 论

通过研究烟草大田生长3个时期(伸根期、旺长期和成熟期)温度变化对烟叶代谢物的影响发现，不同生育期温度变化对烟叶中有机酸、氨基酸、糖类、生物碱、类黄酮、香气物质等都产生了一定程度的影响。总体上，类黄酮物质含量在旺长期和成熟期受温度影响较大，生物碱在旺长期受温度影响较大，糖类物质在伸根期和旺长期受温度影响较大，香气物质、氨基酸和有机酸在3个生育期受温度影响都较大。旺长期温度变化对烟草物质代谢影响最大，其次是成熟期和伸根期。

图6 不同生育期不同温度处理云烟87有机酸变化情况Fig.6 Organic acids contents of Yunyan87 with different temperatures at different growth periods

代谢物种类Varieties生育期Growth period主要差异代谢物Differential metabolites类黄酮Flavonoids伸根期旺长期芸香苷(3.9)、柚皮素-7-O-葡萄糖苷(2.1)成熟期山奈酚-3-芸香糖苷(2.1)、柚皮素-7-O-葡萄糖苷(3.2)香气物质Aroma components伸根期苯甲醇(3.5)、2-乙酰吡啶(2.5)、3-羟基-2-丁酮(2.9)、2,3-戊二酮(2.9)旺长期6-甲基2-庚酮(3.4)、2-异丙基-5氧-己醛(2.8)、2,3-戊二酮(8.0)、3-羟基-2-丁酮(2.3)成熟期新植二烯(2.6)、巨豆三烯酮(2.2)生物碱Alkaloids伸根期旺长期新烟碱(2.6)糖Saccharides成熟期伸根期甘露糖(2.0)旺长期蔗糖(3.5)氨基酸Amino acids成熟期伸根期丙氨酸(2.8)、脯氨酸(3.4)、苯丙氨酸(2.4)旺长期丙氨酸(8.0)、丝氨酸(2.2)成熟期缬氨酸(2.6)、丝氨酸(2.5)、焦谷氨酸(4.6)、苯丙氨酸(3.3)有机酸Organic acids伸根期丙酮酸(2.2)、乳酸(2.2)、丙二酸(2.2)旺长期丙酮酸(2.6)、乳酸(2.0)、丁二酸(2.3)、甘油酸(3.2)、富马酸(2.9)、2,4-二羟基丁酸(3.2)、柠檬酸(7.6)成熟期丙酮酸(5.8)、乳酸(3.8)、丁二酸(3.3)、甘油酸(3.0)、富马酸(2.5)、2,4-二羟基丁酸(2.6)、柠檬酸(3.3)

注：表中括号内数值为最高含量与最低含量比值。

Note:The value in the brackets was the ration of the highest content to the lowest content.

4 结 论

本文从物质代谢的角度研究温度对烟草生长发育的影响，明确了旺长期生长温度是影响烟叶代谢物(特别是次生代谢物，如类黄酮、生物碱、香气物质等)积累最重要的因素。研究结果可为特色烟叶品质的形成和特色优质烟叶开发提供借鉴和参考。