酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡蛋品质、抗氧化能力和胆固醇代谢的影响

杨 玉 孙 煜 孙宝盛 卢营杰 李建慧 张俊珍

(山西农业大学动物科技学院，太谷030801)

硒是人和动物必需的微量元素，缺硒可导致白肌病、克山病、肝硬化、癌症、白内障、心血管与抑郁症等疾病发生。目前，世界上有40多个国家处于低硒或缺硒状态，我国也是严重的缺硒国家之一。由于富硒鸡蛋所含硒为有机态硒，容易被人体吸收利用，在发达国家已利用富硒酵母作为有机硒源，生产富硒鸡蛋上市。而苜草素兼有抗氧化和免疫增强的双重功效，推测苜草素应该在生长周期长或有严重疾病隐患的情况下应用效果更为理想。王宝维等[1]报道，在鹅饲粮中添加不同硒源均显著提高了血清与肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)，显著降低了血清与肝脏中丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量，且酵母硒比亚硒酸钠和纳米硒的抗氧化作用更为显著。硒源和水平对蛋鸡血液硒含量、GSH-Px活性和T-AOC有显著影响，有机硒较无机硒更易于沉积在鸡蛋、肝脏和肌肉等组织中[2-5]，提高鸡蛋硒含量[6-8]和GSH-Px活性[9-10]。苜蓿中的活性物质有增强血清抗氧化能力、降低血清MDA含量以及预防心血管疾病等作用。添加不同水平的苜蓿总甙可以增强肉鸡肝脏和血清GSH-Px活性，降低肝脏和血清MDA含量，使动物机体不被脂质过氧化物伤害[11]。Deng等[12]研究表明，含水苜蓿提取物能够显著降低血清和肝脏的胆固醇以及蛋黄、血清和肝脏的脂质，但对血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量无显著影响。Zhou等[13]进一步利用数字基因表达分析了苜蓿皂苷提取物降低蛋鸡胆固醇的效果，发现添加120 mg/kg苜蓿皂苷提取物效果最好。作者前期研究发现，饲粮中添加苜草素可降低产蛋后期蛋鸡蛋黄总胆固醇和甘油三酯含量，提高生产性能、蛋壳强度、机体抗氧化和胆固醇代谢能力，其适宜添加水平为1 000 mg/kg[14]。但有机硒与苜草素均兼有抗氧化的功效，但其联和使用是否会在鸡蛋品质、动物抗氧化及脂代谢方面产生更好的效果却鲜有报道。因此，本试验通过在饲粮中添加酵母硒和苜草素，进一步探讨其对产蛋后期蛋鸡生产性能、硒沉积、抗氧化、胆固醇及相关基因表达的影响，旨在确定其适宜添加水平及组合，为提高鸡蛋品质和蛋鸡产业的可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

试验于2015年6月11日至2015年8月21日在山西省大同市大同县建鑫养殖场和山西农业大学动物遗传育种与动物营养省级重点实验室进行。

1.2 试验材料与设计

试验用苜草素是一种从紫花苜蓿中提取的天然植物提取物，其有效成分为多糖15%、黄酮5%和三萜皂苷5%，购自四川德阳三丰原科技股份有限公司；酵母硒购自奥特奇生物有限公司，硒含量2 000 mg/kg。试验选用756只69周龄健康状况良好、产蛋率约80%的海兰褐蛋鸡，随机分成7组，每组6个重复，每重复18只鸡。其中1组为对照组，饲喂基础饲粮(硒含量0.20 mg/kg)，参照海兰公司提供的饲养管理手册(2014)并根据建鑫养殖场实际情况做适当修改进行配制，其组成及营养水平见表1；2～7组分别在基础饲粮中添加0.2、0.6和1.0 mg/kg酵母硒与500和1 000 mg/kg苜草素。试验设计见表2。试验预试期2周，期间饲喂基础饲粮；正试期8周。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1)维生素预混料为每千克饲粮提供 The vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 33 000 IU，VD38 100 IU，VK 3 mg，VB13 mg，VB215 mg，VB68.4 mg，VB120.04 mg，D-泛酸钙D-calcium pantothenate 19.2 mg，烟酸 nicotinic acid 54 mg，D-生物素D-biotin 0.06 mg。

2)微量元素预混料为每千克饲粮提供 The trace mineral premix provided the following per kg of the diet：Fe (as ferrous sulfate) 100 mg，Cu (as copper sulfate) 10 mg，Zn (as zinc sulfate) 80 mg，Mn 120 mg，I 0.26 mg。

3)计算值 Calculated values。

表2 试验设计

1.3 饲养管理

试验鸡采用立体3层笼养，每笼3只，鸡只自由采食与饮水，自然光照补充人工光照到16 h；温度(20±2) ℃，相对湿度50%～60%，自然通风结合纵向负压通风；其他均按养殖场常规方法进行。

1.4 指标测定

1.4.1 生产性能

试验期间每日记录各重复的产蛋数、产蛋总重量，每7 d结料，记录各重复耗料重，计算各组平均日采食量，然后以组为单位统计产蛋率和料蛋比。

1.4.2 蛋品质测定

试验第14、28、42和56天，每个重复随机抽取3枚鸡蛋测定蛋品质。采用多功能蛋品质测定仪(ORKA，以色列)测定蛋重、蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色，采用蛋壳强度测定仪(ORKA，以色列)测定蛋壳强度，采用蛋壳厚度测定仪(NFN380，日本)测定蛋壳厚度。

1.4.3 血浆及组织相关指标

试验结束时每重复随机选取1只健康状况良好且体重接近的蛋鸡，空腹翅静脉采血5 mL，3 500 r/min离心10 min制备血浆分装，-20 ℃保存。取同一部位肝脏，按照相应试剂盒测定血浆GSH-Px和T-SOD活性、T-AOC、MDA、胆固醇和甘油三酯含量以及肝脏GSH-Px活性、胆固醇和甘油三酯含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 蛋黄相关指标测定

试验结束时，每重复选取2枚鸡蛋称重，破壳后分离蛋清蛋黄，使用氢化物发生原子荧光分析方法测定蛋黄硒含量；使用试剂盒测定蛋黄胆固醇和甘油三酯含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4.5 肝脏总RNA提取和反转录

对上述采血后的鸡颈静脉放血致死，采用无菌操作迅速取出同一部位肝脏放入液氮中，置于-80 ℃待测。采用Trizol法提取肝脏组织总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳、核酸蛋白仪测定RNA完整性、浓度和纯度。按照反转录试剂盒说明合成cDNA，-20 ℃保存备用。

1.4.6 引物设计

根据测序数据库中GSH-Px1、胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)的序列，设计其引物，由华大基因(北京)合成。

1.4.7 实时定量PCR

1.5 数据处理与统计分析

用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。所有数据以“平均值±标准差”表示，采用单因素方差分析，用Duncan氏法比较各组之间差异，采用LSD法对差异显著的数据进行极显著差异比较，对mRNA表达量进行单因素方差分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

表3 引物序列

2 结 果

2.1 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

由表4可知，各试验组蛋鸡平均蛋重和平均日采食量与对照组比较差异不显著(P>0.05)；除3组和6组蛋鸡产蛋率与对照组差异不显著(P>

0.05)外，其他各试验组蛋鸡产蛋率均显著高于对照组(P<0.05)。各试验组蛋鸡料蛋比均显著低于对照组(P<0.05)，其中以5组产蛋率最高、料蛋比最低。酵母硒和苜草素互作可极显著降低蛋鸡料蛋比(P<0.01)，有提高蛋鸡产蛋率趋势，但差异不显著(P>0.05)。

表4 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡蛋品质以及蛋黄硒、胆固醇和甘油三酯含量的影响

由表5可知，饲粮中添加酵母硒和苜草素具有提高哈氏单位趋势，其中4组哈氏单位显著高于对照组(P<0.05)；2组、4组和5组的蛋壳强度显著高于对照组(P<0.05)；其余各项蛋品质指标各组差异不显著(P>0.05)。蛋黄硒含量随酵母硒添加量的增加而增加，试验组蛋黄硒含量均极显著高于对照组(P<0.01)；各试验组蛋黄胆固醇和甘油三酯含量均低于对照组，其中3组和5组蛋黄胆固醇含量极显著低于对照组(P<0.01)，3组、5组和7组蛋黄甘油三酯含量极显著低于对照组(P<0.01)。酵母硒和苜草素互作对蛋品质及蛋黄硒、胆固醇和甘油三酯含量的影响不显著(P>0.05)。

表5 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡蛋品质以及蛋黄硒、胆固醇和甘油三酯含量的影响

2.3 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡血浆和肝脏抗氧化能力的影响

由表6可知，试验组蛋鸡血浆和肝脏GSH-Px活性极显著高于对照组(P<0.01)；试验组蛋鸡血浆T-SOD活性极显著高于对照组(P<0.01)；除2组和3组蛋鸡血浆T-AOC与对照组差异不显著(P>0.05)外，其余各试验组蛋鸡血浆T-AOC均极显著高于对照组(P<0.01)；2组和4组蛋鸡血浆MDA含量显著低于对照组(P<0.05)，5组蛋鸡血浆MDA含量极显著低于对照组(P<0.01)。酵母硒和苜草素互作可极显著蛋鸡提高血浆和肝脏GSH-Px活性及血浆T-SOD活性(P<0.01)，而对蛋鸡血浆T-AOC和MDA含量无显著影响(P>0.05)。

2.4 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡脂代谢的影响

由表6可知，试验组蛋鸡血浆胆固醇含量有降低的趋势，但差异不显著(P>0.05)；试验组蛋鸡肝脏胆固醇、甘油三酯含量均低于对照组，其中5组、6组和7组蛋鸡肝脏胆固醇与对照组相比差异极显著(P<0.01)，试验组蛋鸡肝脏甘油三酯含量与对照组差异极显著(P<0.01)。酵母硒和苜草素互作对蛋鸡肝脏胆固醇含量影响显著(P<0.05)，对蛋鸡肝脏甘油三酯含量影响极显著(P<0.01)。

表6 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡血浆和肝脏抗氧化能力以及脂代谢的影响

2.5 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡肝脏抗氧化、脂代谢相关基因mRNA表达量的影响

由表7可知，饲粮添加酵母硒和苜草素可极显著提高蛋鸡肝脏TrxR1、CYP7A1和SREBP-1cmRNA表达量(P<0.01)；显著提高蛋鸡肝脏GSH-Px1 mRNA表达量(P<0.05)，且随着酵母硒添加水平的提高其表达量极显著降低(P<0.01)；同时，也极显著降低蛋鸡肝脏HMGCRmRNA表达量(P<0.01)，以5组最低且显著低于7组(P<0.05)。

表7 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡肝脏抗氧化、脂代谢相关基因mRNA表达量的影响

3 讨 论

3.1 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

3.2 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

评价蛋品质的常规指标包括蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数、蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色等。蛋壳强度和蛋壳厚度直接影响鸡蛋抗破损能力，蛋白高度和哈氏单位直接反映鸡蛋新鲜程度。蛋白高度数值越大、哈氏单位越高，则表示蛋白品质优秀，蛋白黏稠度较好。蛋黄颜色主要与蛋鸡摄取类胡萝卜素种类和数量有关。

本试验中，酵母硒和苜草素联用有提高鸡蛋蛋白高度和哈氏单位的趋势，当添加量到0.6 mg/kg酵母硒+500 mg/kg苜草素时，哈氏单位与对照组相比差异显著，这说明添加这2种添加剂后，体内抗氧化作用增强，鸡蛋品质得到改善。本试验中，蛋壳强度均有不同程度增强，但蛋壳厚度变化无规律，原因可能是酵母硒和苜草素中的活性物质，如酵母、皂苷等，影响了蛋鸡体内钙、磷吸收率，从而导致蛋壳密度增大，强度增强，这与Invernizzi等[20]结果一致。

3.3 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡血浆和肝脏抗氧化能力的影响

机体抗氧化功能主要是通过一系列反应清除体内脂质过氧化产物(如MDA、氢过氧化物和H2O2等)，使机体免受这些自由基损伤的过程。体内GSH-Px、T-SOD、T-AOC、MDA、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)等指标均反映机体抗氧化能力。Jing等[10]研究表明，饲粮中添加硒源可提高蛋鸡血浆GSH-Px和T-SOD活性，显著降低血浆MDA含量。Lu等[21]研究表明，机体补充硒源可增加硫氧还蛋白1和硫氧还蛋白2蛋白表达量。史莹华等[11]研究发现，饲粮中添加苜蓿皂苷可提高仔猪血清和肝脏等组织中GSH-Px和T-SOD活性，降低MDA含量。

本试验中，酵母硒和苜草素互作极显著提高了蛋鸡血浆GSH-Px、T-SOD活性以及肝脏GSH-Px活性，降低血浆MDA含量，这与上述研究结论相符；且肝脏中GSH-Px1和TrxR1 mRNA表达量也表现出与血浆一致的规律性，这说明酵母硒和苜草素可在基因转录水平上影响GSH-Px和TrxR的表达，协同提高机体抗氧化酶活性，最终增强机体抗氧化能力。

3.4 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡血浆、肝脏、蛋黄胆固醇和甘油三酯含量的影响

肝脏是机体内脂代谢活动的重要器官，胆固醇在肝脏中转化为胆汁酸是体内胆固醇代谢的重要途径。机体内胆固醇代谢由一系列酶参与调控，其中CYP7A1是胆汁酸合成的限速酶，对维持机体胆固醇稳定具有重要作用。SREBP-1c基因属于固醇调节元件结合蛋白家族，可促进脂肪酸生成并与胆固醇合成胆固醇酯，从而消耗胆固醇[22]。HMGCR是内源胆固醇合成过程中的限速酶[23-24]。研究表明，饲粮中添加硒源对蛋鸡血液胆固醇和甘油三酯含量影响不显著[25]，添加苜草素可降低机体血液、肝脏胆固醇和甘油三酯含量以及鸡蛋中胆固醇的沉积量[12]。Zhou等[13]进一步利用数字基因表达分析了苜蓿皂苷提取物降低蛋鸡胆固醇的效果，认为苜蓿皂苷降低胆固醇的作用是由肝脏中的胆固醇流出，降低卵巢中胆固醇的沉积。本试验中，酵母硒和苜草素互作不仅显著降低了蛋鸡肝脏胆固醇和甘油三酯的含量，而且蛋黄中的胆固醇和甘油三酯含量也随之下降，这与上述研究结果一致。同时本研究发现，添加酵母硒和苜草素极显著提高了肝脏中CYP7A1和SREBP-1cmRNA表达量，极显著降低了HMGCRmRNA表达量，原因可能是HMGCRmRNA表达量的降低直接影响了机体内胆固醇的合成；SREBP-1cmRNA表达量的升高促进了脂肪酸合成相关酶基因的转录翻译，加速了脂肪酸的生成，从而与游离的胆固醇结合生成胆固醇酯，从而降低了胆固醇[22]；CYP7A1 mRNA表达量的升高，加快了肝脏胆固醇向胆汁酸转变，进而降低了卵巢中胆固醇沉积[13]。由此可见，酵母硒和苜草素联用既影响了机体内胆固醇的合成，又影响着胆固醇代谢，从而降低了肝脏和蛋黄中胆固醇和甘油三酯含量。

3.5 酵母硒和苜草素联用对产蛋后期蛋鸡蛋黄硒含量的影响

现有试验表明，鸡蛋中硒含量可随饲粮中添加硒源水平的升高而升高，其中有机硒效果优于无机硒[26-27]。而关于苜草素和酵母硒对蛋硒含量的影响研究较少，且普遍认为苜草素影响机体对微量元素的吸收代谢，主要是通过消化道的代谢促进机体对微量元素(硒、锌、锰等)的吸收。本试验发现，饲粮中添加酵母硒和苜草素，蛋黄硒含量极显著高于对照组，且随酵母硒和苜草素添加量的增加，蛋黄硒含量并未趋于平缓或降低。虽然添加1.0 mg/kg酵母硒+500、1 000 mg/kg苜草素组合与0.6 mg/kg酵母硒+1 000 mg/kg苜草素组合相比，肝脏抗氧化性能及表达量极显著降低，但肝脏中抗氧化指标、GSH-Px1和TrxR1 mRNA的表达量仍极显著高于对照组，说明硒添加水平并未超出蛋鸡机体对硒的耐受力，但以添加0.6 mg/kg酵母硒+1 000 mg/kg苜草素组合效果较好。

4 结 论

产蛋后期蛋鸡饲粮中添加酵母硒和苜草素可有效提高蛋黄硒含量、降低蛋黄胆固醇和甘油三酯含量，改善蛋壳强度，提高生产性能、机体抗氧化和胆固醇代谢能力，有提高鸡蛋蛋白高度和哈氏单位趋势，以添加0.6 mg/kg酵母硒+1 000 mg/kg苜草素组合效果最佳。