硫磺菌多糖的分离纯化及体外抗氧化、抗肿瘤活性初探△

胡亚平，王锦，郑丽，田新利，代玲，林玲辉，王立安

(1.邢台医学高等专科学校，河北 邢台 054000；2.河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050024)

硫磺菌(Laetiporussulphureus)又名黄芝、硫磺多孔菌、硫色多孔菌，独立或者呈簇生长于腐烂的落叶或针叶树种的原木、树桩和树干上，是一种有重要利用价值的食用兼药用真菌，广泛分布于欧洲、亚洲和北美洲的美国[1]。张津等优化了从硫磺菌子实体中提取水溶性多糖的提取工艺[2]；Lung M Y.从硫磺菌菌丝体和发酵液中分别提取胞内多糖和胞外多糖，发现它们均具有一定的抗氧化活性[3]；闫梅霞等发现硫磺菌菌丝体粗多糖对小鼠Lewis肺癌具有一定的体内抑制作用，最大抑制作用达到了35.7%[4]；王娟等发现硫磺菌摇瓶发酵液的乙酸乙酯提取物对8种植物病原菌、1种霉菌、7种细菌都有较为显著的抗菌作用[5]。目前对于硫磺菌多糖的研究相对较少，特别是关于硫磺菌多糖的纯化和结构的研究还鲜见报道。

本实验室前期已完成了硫磺菌野生菌种的驯化。本实验以实验室培育的硫磺菌子实体为材料提取粗多糖，进行分离纯化，并对纯化后的多糖进行了理化特性的研究，以及体外抗氧化活性和抗肿瘤活性的初步探究，以期为硫磺菌多糖的进一步研究和开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硫磺菌子实体，由河北师范大学真菌生化与分子生物学实验室种植；人胃癌BGC823细胞株，保存于河北师范大学真菌生化与分子生物学实验室，液氮冻存，按常规方法传代培养。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、顺铂(DDP)，北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培养基，浙江天杭生物科技公司；实验室用水均为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

VERTEX 70傅立叶变换红外-拉曼-红外显微镜联用光谱仪，德国布鲁克；S-4800冷场发射扫描电子显微镜，日本日立；BioLogicLP 色谱系统，Bio-RAD公司；MULTISKAN GO酶标仪，Thermo美国。

1.3 硫磺菌多糖的制备及分离纯化

1.3.1 粗多糖的制备 新鲜硫磺菌子实体，烘干机干燥，粉碎后得到硫磺菌子实体干粉，称重得质量m1，向其中加蒸馏水加热浸提三次(液料比20 mL·g-1，80 ℃，4 h)，真空抽滤，合并滤液，旋转蒸发仪60 ℃浓缩，将得到的浓缩液采用Sevage法除蛋白[6]，弃掉有机相和蛋白层，得到水相层，重复脱蛋白操作直至无蛋白层析出。向收集的水相层加入4倍体积无水乙醇，于4 ℃冰箱静置醇沉过夜，4 000 r·min-1离心20 min，真空冷冻干燥，得到硫磺菌粗多糖(LSPS)，称重得质量m2。按公式(1)计算LSPS得率。

LSPS得率(%)=m2/m1×100%

(1)

1.3.2 DEAE-52柱色谱 取硫磺菌粗多糖150 mg溶于10 mL蒸馏水中，配成15 mg·mL-1的多糖水溶液，进行DEAE-52离子交换柱色谱，所用色谱柱规格为1.5 cm×23 cm。以0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol·L-1的NaCl溶液进行梯度洗脱，控制流速为2.5 mL·min-1，以4 mL/管收集洗脱液，使用苯酚-硫酸法进行多糖显色，并在 490 nm下测量其吸光度，直到无多糖组分流出，共收集60管。以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线图，合并洗脱峰部分，60 ℃浓缩，-20 ℃真空冷冻干燥后置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4 扫描电镜观察

取适量冻干的多糖样品粉末，通过双面胶粘在样品台上，清除多余的不能被粘附在样品台上的粉末，使得样品台上只保留一层薄薄的待测样品。喷镀金原子，用扫描电子显微镜观察样品表面并拍照。

1.5 葡萄糖标准曲线的绘制及多糖含量的测定

1.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制 采用苯酚硫酸法，参考文献方法[7]稍做改动。用蒸馏水配制10 mg·mL-1的葡萄糖标准液。取10只100 mL容量瓶，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖标准液，定容至刻度。各取2 mL样品放入试管内，分别加入5%苯酚溶液1 mL，浓硫酸5 mL，混匀。冷却至室温后，用酶标仪于490 nm处测吸光度值，以吸光度值(Y)为纵坐标，葡萄糖含量(μg·mL-1，X)为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。得到标准曲线方程式为Y=aX+b。

1.5.2 多糖含量的测定 用蒸馏水配制一定浓度的多糖溶液，浓度为w(μg·mL-1)，取1 mL的多糖溶液用上述的硫酸苯酚法检测，得到吸光度值A1。按公式(2)计算多糖含量。

多糖含量(%)=(A1-a)/wb×100%

(2)

式中：A1为用苯酚硫酸法测定的吸光度值；a、b 为葡萄糖标准曲线公式中的系数值；w 为多糖溶液浓度(μg·mL-1)。

1.6 红外光谱扫描

取2 mg 左右干燥的多糖样品，与 300 mg左右KBr粉末，红外灯下在玛瑙研钵中轻轻研匀压片，进行红外光谱扫描，扫描范围4000～400 cm-1。

1.7 氢谱分析

取多糖10 mg左右，溶于0.5 mL重水(D2O)中，用600 MHz核磁共振仪测定。

1.8 体外抗氧化、抗肿瘤活性测定

1.8.1 抗氧化活性 采用DPPH自由基(DPPH·)清除能力的测定法，参考文献方法[8]稍做改动。用无水乙醇配制0.2 mol·L-1DPPH·工作液，将待测多糖配成不同浓度的样品液，以同一浓度BHT为阳性对照，依次向96孔板中加入100 μL不同浓度的样品液，100 μL的DPPH工作液，室温下暗反应震荡30 min，酶标仪测定517 nm处的吸光度值A。按公式(3)计算DPPH·清除率。

清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

(3)

式中：Ai为100 μL DPPH·工作液+100 μL 样品液的OD517；Aj为100 μL 无水乙醇+100 μL 样品液的OD517；A0为100 μL DPPH·工作液+100 μL 蒸馏水的OD517。

1.8.2抗肿瘤活性 采用MTT 法，参考文献方法[9]稍做改动。用RPMI 1640将待测多糖配成不同浓度的多糖样品液，以同一浓度顺铂为阳性对照。取对数生长期的BGC 胃癌细胞，以1×105个·mL-1细胞浓度接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL，于二氧化碳培养箱(5% CO2，37 ℃)培养24 h 后，加入100 μL多糖样品液，阴性对照组中加100 μL的无血清培养基，并设空白孔。培养48 h后，离心弃去上清，每孔加100 μL MTT(1 mg·mL-1)，继续培养4 h后，离心(2 000 r·min-1，10 min)弃上清，每孔加二甲基亚砜 150 μL，震荡10 min，用酶标仪检测570 nm 的吸光度值A。按公式(4)计算癌细胞增殖抑制率。

癌细胞增殖抑制率(%)=(1-As/A0)×100%

(4)

式中：As为实验组吸光度值；A0为空白对照组吸光度值。

1.9 数据处理

本实验进行三次平行实验，测定结果以平均值±标准差(SD)表示，数据分析采用originpro 7.5、 MestReNova软件和IC50软件。

2 结果与分析

2.1 多糖的制备及分离纯化

从40 g硫磺菌子实体干粉中得到的硫磺菌粗多糖(LSPS)为2.82 g，计算得粗多糖得率为7.05%。

采用DEAE-52离子交换柱对LSPS 150 mg进行分离纯化，梯度洗脱曲线如图1所示。用水和不同浓度的NaCl溶液洗脱，共得到三个洗脱峰，合并各洗脱峰组分，分别对其减压浓缩，冷冻干燥后共收集得到3个纯化后的多糖组分，分别命名为LSPS-Ⅰ、LSPS-Ⅱ和LSPS-Ⅲ，其中LSPS-Ⅰ为水洗脱得到，共获得36 mg；LSPS-Ⅱ和LSPS-Ⅲ分别为0.1 mol·L-1NaCl和0.3 mol·L-1NaCl洗脱得到，分别获得24 mg和4 mg。计算得LSPS-Ⅰ、LSPS-Ⅱ和LSPS-Ⅲ的得率分别为24%、16%和2.7%。因为LSPS-Ⅲ含量太少后续未对其做进一步研究，仅对LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ进行了研究。

图1 硫磺菌粗多糖经DEAE-52离子交换柱的梯度洗脱曲线

2.2 物理性状和扫描电镜观察

图2是LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的电子显微镜扫描结果，给出了多糖样品的表面结构特征。

冷冻干燥后的多糖组分LSPS-Ⅰ呈现白色透明冰晶状，1万倍放大后在扫描电镜下形态如图2 A 所示，呈透明玻璃状，其表面光滑，并伴有一些小的凹槽；冻干后的LSPS-Ⅱ呈现白色粉末状，1万倍放大后在扫描电镜下形态如图2 B所示，呈不规则的砖块状。可见LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ为两种不同的多糖。

图2 LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的扫描电镜图

2.3 葡萄糖标准曲线及多糖含量

以葡萄糖溶液的浓度为横坐标，490 nm吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，数据处理后得标准曲线回归方程：Y=0.008X-0.030，r=0.997。实验表明葡萄糖浓度在0～120 μg·mL-1范围内，吸光度与葡萄糖浓度呈良好的线性关系。通过葡萄糖标准曲线方程，计算得到，硫磺菌粗多糖(LSPS)的多糖含量为(39.13±1.02)%。经过DEAE-52色谱柱得到纯化的硫磺菌多糖LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ，分别为(85.43±1.23)%和(80.12±1.19)%。此结果表明，经过DEAE-52纤维素色谱柱的纯化，硫磺菌多糖的纯度有了明显的提高。

2.4 IR分析

LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的红外光谱仪扫描结果见图3。由图 3 可知，LSPS-Ⅰ在3 421 cm-1处有一明显吸收峰，此为多糖特征性O-H的伸缩振动峰，是由糖分子内或分子间氢键O-H伸缩振动而引起的吸收，形宽且钝，说明羟基不是游离的，而是在分子间发生了缔合[10]；2 927 cm-1附近的吸收峰为次甲基(-CH2)中-C-H的伸缩振动的吸收峰；1 652 cm-1附近的吸收峰为 C=O 伸缩振动峰[11]；1 419 cm-1附近的吸收峰可能是由-COOH中的C-O键伸缩振动或是C-H键的反对称伸缩振动和变角振动引起的[12]；1 020 cm-1附近的吸收峰是由C-O-H和吡喃糖环的C-O-C中的两种C-O键的伸缩振动引起的[13]。

图3 LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的红外光谱图

LSPS-Ⅱ在3 421 cm-1处有吸收，这是 O-H 伸缩振动，与 LSPS-Ⅰ 相似，说明羟基在分子间缔合；2 931 cm-1附近的吸收峰为C-H 伸缩振动；1 652 cm-1附近的吸收峰为 C=O 伸缩振动峰；1 419 cm-1附近有与LSPS-Ⅰ相似的吸收峰；1 024 cm-1附近有与LSPS-Ⅰ相似的吸收峰。

综上所述，由红外图谱可知LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ均具有明显的糖类化合物的特征。

2.5 1H-NMR分析

LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的1H-NMR分析见图 4。1H-NMR主要解决多糖结构中糖苷键构型及结构中氢个数比的问题，但是由于非异头质子化学位移δ相近，且有部分重叠现象，使多数质子信号较难解析，一般β型异头质子区域化学位移位于δ4.4～5.0，α型异头质子区域化学位移位于δ5.0～5.5[14]。LSPS-Ⅰ的1H-NMR 信号中有δ5.35、5.17和5.14，LSPS-Ⅱ的1H-NMR 信号有δ5.39，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的1H-NMR信号均集中在δ5.0～5.5可见这两种多糖均存在α-糖苷构型异头氢。图4中化学位移在δ3.4～4.2之间的信号主要是糖残基上 C2-H 到 C6-H 的信号位移峰[15]。综上分析结果表明，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ均为主要以α构型链接的多糖。

图4 LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的核磁共振氢谱图

2.6 对DPPH·的清除活性

由图5可知，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ与标准抗氧化剂BHT比较，对DPPH·均有一定的清除活性，两种多糖在设定浓度范围内，随着样品浓度增大，清除率相应提高，当样品浓度为6 mg·mL-1时，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的DPPH·清除率分别为(40.64±0.37)%和(35.49±2.79)%，但阳性对照BHT在浓度1 mg·mL-1时，DPPH·清除率已经达到79.82%。计算得，LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ对DPPH·清除率的EC50值分别为10.74和15.67 mg·mL-1，LSPS-Ⅰ对DPPH·的清除活性优于LSPS-Ⅱ。

2.7 MTT

通过检测发现LSPS-Ⅰ对 BGC 细胞增殖无抑制效果，LSPS-Ⅱ对 BGC 细胞增殖的抑制效果见图6，与标准抗肿瘤药物顺铂DDP比较，对BGC细胞有一定的抑制作用，在设定浓度范围内，随着样品浓度增大，抑制率相应提高，当LSPS-Ⅱ在浓度1000 μg·mL-1对 BGC 的抑制率达到了(55.64±1.37)%，其IC50值为 848 μg·mL-1，表现出很强的体外抗肿瘤活性。

图5 LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ对DPPH·的清除作用

图6 LSPS-Ⅱ对BGC细胞的抑制作用

3 讨论和结论

硫磺菌作为一种珍贵的食药用真菌，本实验室已完成对其的野生驯化并高产栽培。本研究首次从自行栽培的硫磺菌中得到了两个多糖组分LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ。由于在多糖纯化中色素和蛋白质等杂质会对其的分离造成干扰，所以在分离前期一般进行除色素和蛋白的操作。本实验提取得到的硫磺菌粗多糖本身颜色为白色无色素干扰，所以后期只进行了Sevage法除蛋白的操作。

由于多糖的分子结构等与其生物学活性具有密切的关系，弄清多糖的结构可以更深入的揭示其在生命过程中的作用[16]。多糖结构的检测手段有很多，本实验主要采用 SEM 观察了LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的物理结构，采用苯酚硫酸法检测了它们的多糖纯度，对于多糖纯度的检测，由于目前尚未找到比较合适的标准品，因此通过各种方法得到的多糖纯度仍是比较粗略的结果[17]。采用 IR 和1H-NMR 分析了它们的糖键结构，表明LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ均具有糖类物质的吸收峰且为α构型。

本实验采用清除DPPH·实验评价LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ的体外抗氧化活性，结果显示这两种多糖均具有较好的体外自由基清除能力，且均呈现良好的剂量效应关系。本实验还探讨了LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ对BGC细胞的抑制作用，LSPS-Ⅱ对 BGC 细胞增殖的具有较好的抑制效果。综上所述，分离自硫磺菌子实体的多糖组分LSPS-Ⅰ和LSPS-Ⅱ可作为抗氧化剂和抗肿瘤制品进一步研究，并应用于食品医药领域。