不同杂种松产脂力及松脂成分的变异研究

吴东山, 杨章旗*, 黄永利

(1.广西壮族自治区林业科学研究院，国家林业局马尾松工程技术研究中心，广西马尾松工程技术研究中心，广西 南宁 530002； 2.广西南宁市林业科学研究所， 广西 南宁 530100 )

澳大利亚杂交松是湿地松(Pinuselliottii.,PEE)和加勒比松(Pinuscaribeae)杂交松的后代，简称为F1代。昆士兰林业研究所在澳大利亚杂交松的人工杂交育种过程中，注意选择速生、抗旱性强、材质优的树种作为亲本，进行了不同组合的杂交，如湿地松与洪都拉斯加勒比松(P.caribaeavar.hondurensis, PCH)杂交的PEE×PCH，湿地松与巴哈马加勒比松(P.caribaeavar.bahamensis,PCB)杂交的PEE×PCB，湿地松与洪都拉斯加勒比松杂交的PEE×PCH(种源间)，湿地松与杂交一代杂交的 PEE×(PEE×PCH)，杂交一代与巴哈马加勒比松杂交的(PEE×PCH)×PCB等杂交育种工作[1]。这些不同的杂种松表现出干形圆满通直、适应性强、生长迅速的杂种优势[2]。松脂是松树除了板材之外最重要的经济产品，我国自上世纪80年代引种杂交松以来，先后进行了各个类型的引种栽培试验和选育工作[3>-7]。但杂交松的松脂研究开展得较少，梅杰娜等[2]研究了湿地松、加勒比松、杂种松3种松脂，结果表明杂种松松脂中枞酸型树脂酸及蒎烯含量较双亲低；庞正轰等[8]研究了PEE×PCH杂种及其亲本湿地松、加勒比松的松脂表明三者成分上没有显著差别。国内引种的PEE×PCH、PCH×PEE、PEE×PCB、(PCH×PEE)×PEE、PCH×(PCH×PEE)杂种中PEE×PCH杂种的生长性状表现最为优良，其他杂种在生产上也具有较优良的潜力[9]。这些优良的杂交种的松脂成分的研究较少，因此本研究对从美国西海岸引种的湿地松、巴哈马引种的加勒比松、洪都拉斯引种的加勒比松及其杂交F1代、回交杂种5种类型松树的松脂成分进行对比分析，以期为更充分开发杂交松松脂资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与原料

采脂测定林位于广西省南宁市林科所国家马尾松良种基地，北纬23°10′，东经108°00′，属热带北缘季风气候，干湿季节明显，年平均气温21.5 ℃，1月平均气温12.5 ℃，年平均有霜日23天，年降雨量 1 246 mm，土壤为第四纪红土发育而成的中壤质厚层赤红壤，土层厚1 m以上，pH值4.5～5.0，试验地海拔120 m左右，地势平坦。共从澳大利亚引种5种湿地松与加勒比松的杂种后代：正交PEE(湿地松)×PCH(洪都拉斯加勒比松)、反交PCH×PEE、PEE×PCB(巴哈马加勒比松)、(PCH×PEE)(或F1)×PEE、PCH×(PCH×PEE)(或F1)，并于1990年营造，对照样为PEE、PCH、PCB。试验林造林设计采用随机区组设计，每个小区种植6株，4次重复。

HP6890气相色谱仪，美国Agilent公司；GCMS-QP5050A型气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司。无水乙醚、无水硫酸钠均为分析纯；水为二次蒸馏水。

1.2 调查内容与统计分析方法

在进行不同杂种松产脂力比较时，采用常规生产下降式采脂法[10]采脂，采割负荷率在35%～45%之间，每1天采割1次，采脂时间为2011年8月15日至10月1日，实际采脂天数为37天，每次分单株记录松脂的质量(即产脂量)，因产脂量是生产上的最终核算指标，林木遗传学上认为产脂量主要由林木本身的特性决定，由此产脂量与采割面等技术操作的关系不大，而松树的产脂力主要受松树本身的遗传控制，因此为了生产及育种改良研究的需要使用产脂量和产脂力来进行比较分析。试验中有关数据的方差统计分析、相关分析均采用SAS(6.12版)软件[11]完成。

1.3 松脂样品采集与主要化学组成测定

1.3.1样品采集 在进行不同杂种松松脂成分的比较时，采用钻孔法在树高、胸径相近的单株上采集样品。将当天采回的新鲜松脂(密封保存)，在实验室中进行甲酯化处理。另取部分松脂进行减压蒸馏分离出松香和松节油。

1.3.2样品处理及分析 将直接采集到的松脂搅拌均匀，各取约0.4～0.5 g于烧杯内，加入6～7.5 mL无水乙醇溶解，过滤于具塞试管中，加入0.5%的酚酞作为指示剂，用25%四甲基氢氧化铵水溶液滴至红色，30 s不退色[12]即视为松脂中的树脂酸完全甲酯化。加入少量无水硫酸钠作吸水剂，高速离心机10 000 r/min离心分离2 min，将处理好的试样取上层清液放置4 h后做GC-MS分析，取实验中分离得到的松节油和甲酯化试剂做校正误差和空白对照。

气相色谱条件[13]:色谱柱DB-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，分析条件为程序升温初始温度60 ℃(保持2 min)，以4 ℃/min的升温速率升至260 ℃(保持10 min)，汽化室和检测器温度均保持在260 ℃[13]。氢火焰离子检测器(FID)，载气为高纯氮，氮气压力0.1 MPa；氢气流速50 mL/min，空气流速50 mL/min，分流比1∶50，进样量为0.3 μL。

质谱分析条件：离子源EI，电子能量70 eV，离子源温度250 ℃，扫描范围50～150 u，扫描时间0.2 s，进样量0.3 μL。

1.4 数据处理

松脂各组成的百分含量为扣除溶剂峰后剩余所有峰面积总和作为基准，取各个组分的平均值按照面积归一化法进行计算。所得的质谱图直接与该机中的NIST数据库检出的标准图谱进行对比，并参照相关文献[14～17]进行定性分析，少数峰则依据相对保留时间和质谱数据与标准样品的数据相结合进行定性。

2 结果与分析

2.1 杂交松及对照的产脂力和松脂产量分析

在引种的国外松中，湿地松、加勒比松及其杂交种属于产脂量较高的树种。从表1的湿地松与加勒比松不同杂种的产脂力及产脂量分析结果可看出：杂交F1代中PEE×PCB在十月份产脂力低于亲本PEE，以及回交代(子代与亲本杂交的产物)杂种PCH×F1产脂力在八月份低于亲本PCB，其余杂交种及回交子代的产脂力在各个月份间均高于湿地松、加勒比松对照。与对照比较，不同的杂种松树在不同的月份中产脂量有不同的变化，杂种PEE×PCH在所有月份的产脂量均高于3个亲本对照，杂种 PCH×PEE在不同月份间产脂量呈曲线型变化，但产脂量均低于亲本PEE，说明该种的产脂量相对于亲本PEE来说不具有优势，杂种PEE×PCB 的产脂量变化与杂种PCH×PEE类似，其一个显著特征就是相对于亲本PCB不具有杂种优势，因此，在进行遗传改良设计时应当进行适当的选择，筛选出具有杂种优势的个体。在整个采脂周期内，PEE×PCH、PCH×PEE、PEE×PCB、(PCH×PEE)×PEE、PCH×(PCH×PEE)杂种产脂力分别取平均值比3个对照均值高74.55%、 23.27%、 37.19%、 65.26%、 46.71%。比较杂交F1代和回交代发现，PEE×PCH杂种产脂力及产脂量表现最好。

表1 各杂种与对照产脂力及产脂量统计

表2为不同杂种松树产脂力及产脂量的方差分析，比较对照亲本与杂交后代的产脂力值以及表2产脂力及产脂量的方差分析可知，产脂力以及产脂量在不同杂种间均达到显著差异，20年生时马尾松人工林分已达成熟期，产脂力性状在亲本和子代中的表现已处于相对稳定水平。各杂种产脂力高于其亲本平均产脂力，表明存在杂种优势，通过杂交手段可以提高松脂产量。

表2 各杂种与对照产脂力及产脂量方差分析

1)**:0.01显著水平；*：0.05显著水平；下同**： the significant level of 0.01; *: the significant level of 0.05;similarly hereinafter

通过应用产脂力及产脂量的数据进行多重分析软件比较不同杂种松脂在2个性状指标上的差异程度来说明杂种间及相对于亲本对照的优劣性，根据多重比较软件的分析规则是带有相同字母的性状表示差异不显著，带有不同字母的性状表示差异显著。结合表1统计数据以及表2的方差分析，多重比较结果如表3所示，表3中的产脂力和产脂量是针对整个采脂周期内不同杂种松树的比较，分别取每个树种在整个周期内产脂力及产脂量的总和数据分2个显著等级进行比较，产脂力在0.05水平时，PEE×PCH杂种表现最优，与其他杂种及对照差异显著，洪都拉斯加勒比松的产脂力最低，且与其他杂种差异显著；在0.01水平上，PEE×PCB杂交种与回交杂交种F1×PEE产脂力差异显著，F1代与回交代比较，PEE×PCH除了与回交代F1×PEE差异不显著外，其余杂种均存在显著差异。在产脂量方面，PEE×PCH杂种在2个显著性水平上都表现出与其他样本显著的差异，F1×PEE回交杂种也具有较好的生产潜力，其他杂种与亲本产脂量差异不显著。

表3 不同树种(杂种)产脂力及产脂量的多重比较1)

1) 小写字母表示0.05水平差异显著，大写字母表示0.01水平差异显著lowercase indicates the significant level of 0.05,capital letter indicates the significant level of 0.01

2.2 杂交松及其对照松脂性状的比较

通过气相色谱-质谱联用分析技术共分析得到各杂种松及其对照松脂组分58种，占总分析量的97%以上，主要组分共17种(峰型面积大于0.01%的组分，见表4)，其峰型面积总和占总峰型面积的91%以上，其中主要单萜烯化合物8种，分别为α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、月桂烯、3-蒈烯、对伞花烃、柠檬烯、β-水芹烯，峰型面积在23.38%～34.01%之间；主要二萜树脂酸化合物9种，分别为异海松酸、海松酸、湿地松酸、山达海松酸、左旋海松酸、长叶松酸、去氢枞酸、枞酸、新枞酸，峰型面积在62.50%～71.41%之间。除了单萜烯及二萜树脂酸之外的非烯类、二萜醛、二萜醇等少量物质的其他成分平均峰型面积在0.78%～3.54%之间。对各杂种松及亲本的含油量进行研究发现，松脂的含油量与单萜烯及二萜树脂酸主要成分表现出不同的变化规律。松脂含油量(松节油得率)在13.29%～31.02%之间，含油量较高。PEE×PCH杂种、F1×PEE杂种以及湿地松对照的含油量高于广西优良马尾松松脂含油量[18]，巴哈马加勒比松以及洪都拉斯加勒比松含油量均低于15%，在不同杂种中，PCH×PEE反交杂种表现较差，仅高于加勒比松单亲本含油量，而PEE×PCH正交杂种的含油量超过双亲本，具有优良的杂交表现。在回交杂种中，湿地松做亲本的杂种含油量高于加勒比松做亲本的杂种，另外，加勒比松做亲本时的回交杂种含油量比亲本加勒比松高45.4%。在F1代方面，表现较差的杂种PCH×PEE也比加勒比松亲本含油量高24.6%，这些结果表明，除了杂种PEE×PCH对双亲本都具有杂种优势外，其他杂交种在含油量性状上相较于双亲本不全具有杂种优势，回交杂种F1×PEE、PCH×F1相对于杂种一代PEE×PCH、PCH×PEE、PEE×PCB的含油量差异更小，杂种一代的变异更为丰富。

表4 各杂种与对照松脂含油量及松脂主要成分统计

分析不同杂种及对照发现，松脂主要的单萜烯化合物中，α-蒎烯、β-蒎烯峰型面积总比例超过19%，在主要单萜烯含量方面，杂种一代PEE×PCH、 PCH×PEE、 PEE×PCB中湿地松做母本时具有明显的杂种优势，此时杂交种表现的是高于母本的单亲杂种优势，对父本不做要求，主要单萜的含量平均比亲本均值高2.73%，其中除了杂种PEE×PCH和PCH×PEE的α-蒎烯含量低于亲本PCH外，PEE×PCB的杂种优势明显，月桂烯、 3-蒈烯、对伞花烃、柠檬烯相对于亲本湿地松不具有杂种优势。从β-蒎烯、莰烯、β-水芹烯峰型面积比例看， PCH×PEE的β-蒎烯小于PEE和PCH，PEE×PCH的莰烯和β-水芹烯小于PEE及PCH，以上几个组合杂种不具备杂种优势，其余β-蒎烯、莰烯、β-水芹烯中PEE×PCH、 PCH×PEE具有杂种优势，且在3个杂种一代中，PEE×PCH的β-蒎烯的含量最高，远高于其他2个杂种，并超过湿地松亲本109.10%，而回交杂种一代F1×PEE和PCH×F1的表现则有不同的规律，湿地松做亲本时，β-蒎烯的含量高于PCH×F1及亲本湿地松、加勒比松含量。PCH×F1的莰烯、月桂烯、对伞花烃、β-水芹烯不具有杂种优势，3-蒈烯、柠檬烯均具有杂种优势，且柠檬烯的杂种优势最明显，PCH×F1杂种中柠檬烯的量达到3.04%，其在亲本中的量分别为1.46%和2.32%，分别高出湿地松、加勒比松亲本108.22%及31.03%。另外，一般情况下，湿地松和加勒比松松脂中，除了成分α-蒎烯和β-蒎烯以外，主要还含有β-水芹烯，但在松脂样品中发现回交代杂种中含有少量的柠檬烯成分，且其含量超过了β-水芹烯的含量，通过GC-MS分析图谱检索及柠檬烯和β-水芹烯的标准品进行GC叠加分析，进一步证实了两者的出峰位置和顺序。这说明杂交既增加了松脂的含油率，同时也改变了松节油的组成特性，推测遗传基因在杂交时发生了改变。在主要二萜树脂酸方面，不同杂种松中只有PCH×F1的总含量与亲本有显著的差异，杂种PEE×PCH及F1×PEE的湿地松酸成分均低于湿地松及加勒比松亲本，表明在这2个杂种中湿地松做亲本的表现均没有杂种优势。在回交杂种F1×PEE、 PCH×F1中，枞酸和新枞酸的含量均具有明显的杂种优势。结合来看，湿地松和加勒比松通过杂交和回交之后，松脂中松节油的变化较为明显，一些原来在亲本中含量微小的物质得到增加，并增加了松脂的含油率，初步的实验推测可能存在杂交过程中基因突变的发生。

各杂种与对照松脂含油量及松脂成分的方差分析表明(表5)，松脂的含油量、β- 蒎烯、柠檬烯、左旋海松酸、去氢枞酸、新枞酸含量存在显著的差异，说明杂交育种手段对这些松脂成分的合成与分泌产生了积极的影响，因此，通过针对性的杂交育种技术有可能得到松脂中某些组分的富集。

表5 各杂交组合与对照松脂含油量及松脂主要成分方差分析

2.3 PEE×PCH组合产脂力及松脂主要成分相关分析

根据上述松脂分析结果表明，PEE×PCH杂种的松脂产量、产脂力、性状表现最为突出，为了分析杂种组合中松脂产脂力及组分之间的关联程度以便在后期的杂交育种中进行合理的筛选优良杂交个体，根据分析法则性状之间的关联程度分别以不相关、弱相关、显著相关表示。采用SAS统计分析软件对杂种松的产脂力与松脂主要成分进行相关分析，结果见表6。

表6 PEE×PCH组合产脂力及松脂主要成分相关分析

结果表明产脂力与松脂含油量及松脂主要成分相关性不显著，其中产脂力与单萜烯烃中柠檬烯表现出弱负相关关系。枞酸型树脂酸与海松酸型树脂酸及α-蒎烯相关性不显著。含油量与β-蒎烯、左旋海松酸呈极显著相关，与柠檬烯为显著相关；在单萜烯烃中，仅有β-蒎烯与柠檬烯有显著相关，双萜类化合物中，仅有左旋海松酸与β-蒎烯、柠檬烯呈显著正相关。从松脂组分中单萜及二萜主要化合物的相关性分析可知，各组分之间的相关性程度的紧密性，另外，松脂的含油量、松脂产量、松脂组分受到不同程度的遗传基因控制，这为高应用价值组分在林木育种上的协同改良提供了可能的方案。

松树产脂力及松脂组分的研究已经取得了不少的成果，通过杂交育种方法来提高松脂的产量及改良松脂的组分是一个重要而有效的途径。通过对不同杂种松树松脂的进一步研究，初步揭示了松脂产脂力、松脂产量、松脂中各个主要成分的相对变化情况，能够为高产脂、高经济松脂组分的杂交育种策略的制定提供数据参考。

3 结 论

3.1湿地松与加勒比松的种间杂交是目前松树杂交育种中最成功的案例，其杂交品种表现出优良的产脂性能。通过比较各杂种与对照的产脂力及产脂量发现，产脂力及产脂量在不同的杂交种及对照上都存在显著的差异，各杂种的产脂力均高于对照树，在整个采脂周期内，PEE×PCH、PCH×PEE、PEE×PCB、(PCH×PEE)×PEE、PCH×(PCH×PEE)杂种产脂力分别比3个对照均值高74.55%、23.27%、37.19%、65.26%和46.71%。F1代中正交杂种产脂力高于反交杂种，而回交杂种产脂力又高于反交杂种，但在所有参试材料中，PEE×PCH杂种产脂力及产脂量表现最好。

3.2从不同的杂种的松脂含油量及松脂成分与对照比较来看，也存在不同程度的差异。其中松脂含油量、β-蒎烯、柠檬烯、左旋海松酸、去氢枞酸、新枞酸存在显著的差异，且不同的杂交种松脂都表现出较高的β-蒎烯、柠檬烯含量特征。PEE×PCH正交杂种的含油量超过双亲本，具有优良的杂交表现。

3.3最优杂种PEE×PCH的松脂产脂力及松脂成分的相关分析表明，产脂力与松脂含油量、松脂组分相关指数为-0.141～0.643，显著性检验结果为相关性不显著，含油量与β-蒎烯、左旋海松酸的相关指数分别为0.002及0.009，达到极显著相关水平，而且含油量与柠檬烯的相关指数为0.012，达到显著相关水平；枞酸型树脂酸与海松酸型树脂酸、单萜烯烃之间的相关性指数为-0.843～0.76，相关性不显著。这说明了松树的产脂力与含油量及松脂组分可能受到不同的遗传基因控制，而含油量与松脂的组分上受到遗传基因控制的关联性更密切，因此，建议在进行松脂性状遗传改良过程中应当给予此类关联性密切的基因型性状更多的关注。