传统与仿生机制高温曲培养过程中生化指标的对比研究

张 健，李 波，程平言，向祖祥，胡 峰

(贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州习水564622）

高温大曲在酱香白酒酿造过程中起到糖化剂、发酵剂、增香剂的作用[1]，“曲乃酒之骨”，好曲出好酒，优质高温曲对白酒的产质量有重要的作用。高温大曲为酱香酒酿造过程的呈香提供了多种香味前体物质，从而利于酱酒风味的形成。大曲的品质与曲房的培养过程密不可分，培养过程中曲坯微生物的种类、数量以及理化指标是反映曲坯发酵好坏的关键因素。压制成型的曲坯入曲房后，通过自然接种发酵、富集曲房环境中微生物形成了复杂的发酵微生物菌体系，经过30多天的发酵培养，形成了富含菌、酶、物三系[2]的曲块，继续贮存4～6个月制成成品曲，为酿造好酒奠定了基础。

传统人工制曲方式，劳动强度大，生产效率低，人工成本高。随着白酒行业机械化的推进，习酒在节能降耗的背景下，创新高温制曲工艺，在行业当前的制曲机的基础上，提出仿生学原理，最终与四川宜宾岷江机械厂共同合作，成功开发了仿生机械压曲机[3]，压制过程和人工踩曲相似。仿生机制曲的应用，能否达到人工曲品质，满足生产需求，曲坯的培养发酵过程至关重要，本研究通过对培养发酵过程中仿生机制曲曲坯微生物的数量、种类以及理化指标（水分、酸度、发酵力、液化力、酯化力、糖化力）进行实验分析，并与同期培养的传统曲各相应指标进行对比分析研究，从而发现它们之间的差异，为仿生机制曲的好坏提供参考，保障仿生机制曲在酿酒中的投产应用效果，通过本研究进一步丰富习酒酿酒机械化研究体系、完善了习酒酿酒微生态体系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 曲样来源

习酒公司高温制曲车间同一生产轮次传统班和机械制曲班的曲样。

1.1.2 试剂

微生物分离培养试剂见（1.1.3）；理化检测试剂参照《白酒生产技术全书》[4]《酿酒大曲通用分析方法》[5]的使用试剂。

1.1.3 培养基

细菌分离培养基：牛肉膏0.3 g，NaCl 0.5 g，蛋白胨1 g，琼脂粉2 g，pH值7.2～7.4，蒸馏水100 mL，121℃灭菌20 min。

孟加拉红培养基（霉菌）：蛋白胨0.5 g，葡萄糖1 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.05 g，孟加拉红0.003 g，琼脂粉2 g，氯霉素0.01 g，pH值7.0～7.4，蒸馏水100 mL，121℃灭菌20 min。

酵母分离培养基：蛋白胨0.5 g，葡萄糖5 g，酵母浸粉0.5 g，琼脂粉2 g，青霉素0.01 g，储备液A4 mL，储备液B 0.1 mL，储备液C 0.1 mL，蒸馏水100 mL，pH=6.5，121℃灭菌20min，灭菌后加储备液C0.1mL。

储备液A：K2HPO41.1 g，KCl 1.0 g，CaCl20.3 g，MgSO40.2 g，蒸馏水100 mL。

储备液B：FeCl30.25 g，MnSO40.12 g，蒸馏水100 mL。

储备液C：0.44 g溴甲酚绿溶于20 mL无水乙醇。

1.2 仪器设备

主要设备：电子天平，分析天平，超净工作台，标准移液枪，生化恒温培养箱，电热恒温干燥箱，恒温水浴锅，秒表，白瓷板，电子万用炉。

1.3 实验方法

1.3.1 微生物平板计数实验方法

（1）曲样的采集方法

分别采取人工和仿生机制曲曲房第一次翻曲、第二次翻曲、拆曲时的曲样，样品保存于无菌密封袋，各取200 g，粉碎混匀，4℃保存备用。

（2）曲样的前处理

将采集的样品四分法称取10 g，加入90 mL无菌0.9%的生理盐水中，振荡摇匀，置于恒温摇床，以适当的速度，培养活化12 h后，取出静置。进行梯度稀释得到菌悬液，取各浓度的菌悬液0.1 mL分别涂布在提前灭菌备用的细菌、霉菌、酵母平板上。

（3）微生物培养分离与计数

细菌分离平板置于37℃的恒温培养箱中，培养24 h后开始记录细菌的总数与种类，酵母分离平板置于28℃的恒温培养箱，培养48 h后记录总数与种类。霉菌分离平板置于28℃的恒温培养箱，培养3～7 d观察记录总数与种类。

根据仿生机械曲和人工曲不同培养时间曲样所得微生物种类和数量进行对比分析，得出两种曲微生物指标间的异同。

1.3.2 理化指标的检测方法

参照《白酒生产技术全书》[4]《酿酒大曲通用分析方法》[5]。

（1）水分测定

称取10.0 g曲样于干燥洁净的称量皿中，记录总重量，将其置于温度为125℃的恒温干燥箱内，烘2 h直至恒重，取出放入干燥器中冷却30 min，称重，记录重量，计算大曲水分（水分含量以百分比表示）。

（2）酸度测定

称取约10 g曲样，置于250 mL三角瓶中，记录样品重量，准确加水100 mL，搅匀，在室温下浸泡15 min。每隔5 min搅拌1次。用双层纱布或脱脂棉过滤浸提液，弃去初滤液20 mL，用三角瓶接取滤液备用，即为待测液。

准确吸取10.0 mL待测液于250 mL三角瓶中，加水约20 mL，摇匀，加2滴酚酞作为指示剂，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至呈微红色，且30 s不褪色。记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，根据消耗体积计算结果（酸度为10 g绝干大曲消耗0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液的毫摩尔数，单位为mmol/10 g）。

（3）发酵力测定

取玉米粉原料50 g，加水250 mL，混匀，蒸煮1～2 h，使呈糊状，冷却到60℃。加入原料量15%的大曲粉，再加50 mL 60℃的水搅匀。在60℃下糖化3～4 h，取出1滴与0.1 mol/L碘标准溶液反应直至不显蓝色为止。即为糖化液。

用移液管吸取糖化液50 mL于250 mL三角瓶内，用石蜡密封发酵瓶，无菌条件下加入曲粉1 g，发酵瓶中加入5 mol/L硫酸溶液10 mL，用石蜡密封发酵瓶，擦干瓶外壁，在分析天平上称量，记录称量结果，然后放入30℃恒温箱中发酵48 h。取出发酵瓶，轻轻摇动，使二氧化碳全部逸出，在同一条件下称量，记录称量结果，计算发酵力大小（在30℃、48 h内0.5 g大曲利用可发酵糖类所产生的二氧化碳克数为一个发酵力单位，符号为U，以“g/0.5 g·48 h”表示）。

（4）酯化力测定

吸取己酸-乙醇溶液100 mL，于250 mL蒸馏瓶中，加入相当于绝干样品5 g曲粉，在恒温箱中35℃酯化100 h，取出后加水50 mL。加热蒸馏，接出馏出液100 mL，作为酯化力含量的测定液。吸取50 mL馏出液，加入酚酞指示剂3滴，用氢氧化钠标准溶液中和至微红色出现，准确加入氢氧化钠标准溶液25 mL，沸水浴中回流30 min，冷却后用硫酸标准溶液滴定到微红色消失为终点，计算酯化力（5 g大曲在35℃，经过100 h催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克数为一个酯化力单位，符号为U，以“mg/50 g·100 h”表示）。

（5）糖化力测定

称取相当于10 g绝干曲样品于大烧杯中，根据测定的曲样水分查得应加水量，再加入20 mL pH 4.6乙酸-醋酸钠缓冲液充分搅拌，在35℃水浴中浸泡1 h，用滤纸过滤，滤液备用，于100 mL试管中加3%可溶性淀粉25 mL，置于35℃水浴中保温15 min，加大曲浸出液5 mL，迅速摇匀计时，并立即吸取5 mL混合液注入盛有斐林甲、乙液各5 mL和20 mL蒸馏水的三角瓶中，剩余的混合液继续在35℃水浴中准确糖化1 h，立即吸出5 mL糖化液注入另一盛有斐林甲、乙液各5 mL和20 mL蒸馏水的三角瓶中，定糖（在35℃、pH 4.6条件下，1 g绝干曲1 h转化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克数为一个糖化力单位，符号为U，以“mg/g·h”表示）。

（6）液化力测定

称取相当于10 g绝干曲样品于大烧杯中，用缓冲液以35℃浸泡30 min，用滤纸过滤，滤液为供试酶液。吸取20 mL 2%可溶性淀粉溶液和5 mL pH 6.0缓冲液溶液于25×100 mL试管中，于水浴中预热60 min，准确加入5 mL稀释酶液，立即计时。充分摇匀后，定时用滴管取出约0.5 mL反应液，滴入预先盛有稀碘液的白瓷板中，呈色反应由蓝紫色逐渐变为红棕色，直至与标准比色溶液颜色相同为止，即为反应终点，记录反应时间，计算液化力（在35℃，pH 6条件下，1 g绝干曲1 h能液化淀粉的克数为一个液化力单位，符号为U，以“g/g·h”表示）。

根据实验方法测定仿生机制曲与人工曲培养不同时间的各理化指标数据，对比分析两者的差异，得出实验结论。

2 结果与分析

2.1 机制曲与人工曲微生物培养结果与分析（表1）

表1 人工曲与机制曲的微生物种类对比分析

通过仿生机制曲与人工曲微生物的分离培养实验，从表1数据分析表明：第一次翻曲时两者的微生物培养结果细菌的种类最多，有14种，霉菌、酵母的种类较少，两者主要微生物细菌、酵母的种类基本一致；随着培养时间的延长，到拆曲出房时，两者的主要微生物细菌、霉菌、酵母的种类都明显比第一次翻曲时减少，但细菌种类仍然最多，机制曲8种，人工曲7种，霉菌均为两种，酵母的种类最少，都只有1种。通过实验得出：仿生机制曲3个培养时期的主要微生物种类均和人工曲相应培养时期的微生物种类保持基本一致，差异小，因此仿生机制曲微生物种类达到人工曲的标准，采用仿生机制曲不会影响高温大曲微生物的种类。

表2 人工曲与仿生机制曲的微生物数量对比分析

从表2微生物数量实验数据对比分析表明：两者的微生物数量第一次翻曲时最多，细菌的数量最多，霉菌、酵母的数量较少，细菌数量到达106，霉菌、酵母的数量为103；随着培养时间的延长，第二次翻曲时两者的霉菌数量增多，达到104，基本相当，拆曲出房时，两者的主要微生物的数量都变少，但细菌数量仍然最多，为105，霉菌为103，酵母为102，酵母最少。通过实验数据分析得出：仿生机制曲3个培养时期的主要微生物数量均和人工曲相应培养时期的微生物数量保持一致，说明仿生机制曲微生物数量达到人工曲微生物的标准，采用仿生机制曲培养过程中微生物的数量不会受到影响，仿生机制曲生产达到公司高温大曲微生物的标准。

通过微生物实验证明仿生机制曲和人工曲曲房培养过程中3个时间段的微生物种类、数量都保持一致，说明仿生机制曲不影响高温大曲的微生物生长。

2.2 理化指标的结果与分析（表3）

表3 人工曲与仿生机制曲理化指标对比分析

表3实验结果表明：仿生机制曲的3个培养时期的主要理化指标水分、酸度、糖化力、液化力、酯化力、发酵力和人工曲的指标基本保持一致。拆曲出房时人工曲的水分含量为12.7%，酸度0.79 mmol/10 g，糖化力336.45 U，液化力1.29 U，酯化力18.62 U，发酵力1.62 U；仿生机制曲的水分含量为13.2%，酸度0.67 mmol/10 g，糖化力318.87 U，液化力0.84 U，酯化力20.85 U，发酵力1.64 U；通过数据分析得出，仿生机制曲与人工曲在第一次、第二次翻曲时各理化指标保持一致，而拆曲出房时两者的各项指标同样趋于一致，相差不大，仿生机制曲理化指标达到人工曲标准，达到公司标准要求。

3 讨论

酱香型大曲培养过程中主要微生物细菌、霉菌、酵母的种类与数量可以直接反映曲房中曲坯的发酵是否正常，曲坯的发酵是复合发酵过程，培养过程中微生物种类越丰富，数量越多，成品曲积累的各种酶系越丰富，成品曲中微生物的代谢产物越多，为酿酒提供的前体物质越多[6]。

理化指标中水分、酸度、液化力和糖化力反映酱香型大曲是否成熟；发酵力和酯化力是酱香型大曲的生化性能，反映了酱香型大曲品质。通过对比分析仿生机制曲与人工曲培养发酵过程中3个时期的各项理化指标，可以提前预判最终成品曲的品质，因此通过微生物指标、理化指标的分析对比可知，仿生机制曲与人工曲存在品质差异[7]。

从实验结果可以推断，第一，仿生机制曲和人工曲在发酵培养的各阶段微生物种类和数量基本一致，表明仿生机制曲不会影响高温大曲的微生物种类和数量；第二，通过对理化指标的实验测定，结果表明两者各样品的理化指标虽有差异，但总体比较接近，且最终拆曲出房时所有理化指标数值大小均在企业标准范围内，符合酱香型大曲的理化指标符合地方标准DB 52/T871中的规定。

本研究表明，仿生机械制曲能够达到人工曲微生物指标、理化指标要求，对高温大曲的品质没有不利影响。

为了加快白酒行业两化融合，推进白酒行业机械化进程，习酒仿生机制曲的开发成功地为同行提供了技术参考。仿生机制曲能够达到人工曲质量标准，符合酱香型白酒的生产需要，同时也能节能降耗，节约成本，提高工作效率。