北京鸭关节炎病例的细菌分离与鉴定*

田雪，孙晓军，刘存霞，黄兵，李玉峰，宋敏训

（山东省农业科学院家禽研究所 家禽疫病诊断与免疫重点实验室，山东 济南 250023）

随着我国肉鸭养殖的快速发展，肉鸭各类传染性疫病也呈逐渐增加趋势。除了禽流感、鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭坦布苏病毒感染等病毒性疫病以外，鸭的细菌性疾病也同样威胁着肉鸭生产。目前已知的鸭细菌类病原包括鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和鸭疫巴氏杆菌等，这些细菌常常混合感染或在其他病原感染后引起继发感染，还能作为条件性致病菌长期存在于鸭舍环境中。近年来，肉鸭关节炎发病较为普遍，病鸭表现跛行甚至瘫痪，主要症状为跗关节和/或指关节肿胀，我们从不同来源的表现关节炎症状的北京鸭体内分离到部分细菌，通过16s rDNA测序进行了种属鉴定，并通过动物试验对其致病性进行了分析。

1 材料与方法

1.1 试剂 pMD-18T克隆载体购自TAKARA公司；PCR扩增试剂盒、核酸提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司，酵母粉、胰蛋白胨、琼脂粉等细菌培养基及其他试剂购自上海生工公司。

1.2 引物 参照文献[1]合成两对细菌16S rDNA通用引物，其中8F和1492R配对使用，sgF和sgR配对使用，扩增片段长度均为1.5kb左右，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物序列为：

8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' ；

sgF：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' ；

sgR：5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3' 。

1.3 细菌分离与培养 从表现关节炎症状的北京鸭肝脏、脾脏、脑和关节液等器官或部位进行细菌分离，分别接种普通LB平板和血清平板，于普通培养箱和二氧化碳培养箱 （5%CO2）37℃培养18～24h，观察记录细菌生长状况及菌落形态、颜色等，必要时进行二次纯化培养。挑取培养或纯化后的单菌落，涂片进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌形态。

1.4 药物敏感试验 将100μl 0.5麦氏单位的纯化菌液均匀涂布于M-H药敏平板上，贴上药敏纸片后37℃恒温培养 24h，按照文献[2]方法判定敏感、中敏或耐药。

1.5 16S rDNA序列测定及分析 参照文献[3]方法提取细菌基因组作为模板，按照如下比例配制反应体系：细菌基因组模板1～10ng，16S rDNA上下游引物 （10pM） 各 1μl，dNTP（10mM）0.5μl，Taq酶（5U/μl）0.5μl，10×PCR buffer 2.5μl，补充 去 离子水至 25μl，PCR反应条件为：95℃预变性 5min，95℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 2min，共进行 30 个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物电泳鉴定后，用DNA凝胶回收试剂盒回收阳性条带，克隆至pMD-18T载体，鉴定阳性质粒送上海生工公司进行测序。测定序列提交NCBI网站进行BLAST比对以鉴定细菌种属。

1.6 动物试验 选取12个代表性分离菌株经纯化培养后涂布于5%血清琼脂平板，37℃恒温培养18h，将菌苔用玻璃棒刮下，用PBS缓冲液悬浮并稀释至浓度为1×109CFU/ml待用。65只7日龄健康雏鸭随机分成13组，每组5只，其中1～12组分别经腿部肌肉注射稀释后的菌液0.5ml，对照组腿部肌肉注射PBS缓冲液0.5ml，试验鸭均饲养于隔离器中，每日观察记录试验鸭精神状态和发病情况，10d后逐只称重，剖检观察器官病变，并从关节和肝脏重新分离细菌。

2 结果

2.1 细菌分离及鉴定 从不同来源表现关节炎症状的北京鸭体内共分离到细菌23株，经革兰氏染色观察，其中20株为革兰氏阳性球菌或杆菌，3株为革兰氏阴性杆菌，利用Blast将细菌的16S rDNA序列与GenBank中已知序列进行比对发现，12个革兰氏阳性分离菌株属葡萄球菌属（Staphylococcus），7个革兰氏阳性分离菌株属棒状杆菌属 （Corynebacterium），3个革兰氏阴性分离菌株属大肠杆菌属，另外有1个分离株Jeotgalicoccus schoeneichii尚不明分类地位，鉴定结果见表1。

表1 分离菌株鉴定结果

2.2 药物敏感试验 结果显示，阿莫西林对分离菌株具有较好的抑制作用，所有菌株均在中敏以上，没有出现耐药菌株；其次为阿米卡星，仅有2个分离菌株对其表现为低敏；再次为头孢噻肟，仅有4个分离菌株对其表现低敏；抑菌效果较差的药物是氟苯尼考、阿奇霉素和恩诺沙星，除3个大肠杆菌分离株对其敏感以外，其余大多数分离菌株对三种药物均有不同程度耐药。分离菌株Jeotgalicoccusschoeneichii（D3)仅对阿莫西林敏感，对供试的其他药物均表现为耐药。3株大肠杆菌除其中2株对强力霉素表现耐药以外，对其他药物均在中敏以上。其余分离菌株对供试药物均表现为不同程度耐药，结果见表2。

表2 药物敏感试验结果

2.3 将 12 个代表菌 株 （D3、D4、D5、D6、D7、D9、D11、D12、D13、D17、D19 和 D20）培养物接种试验鸭，连续观察10d，各组试验鸭精神、采食均正常，未表现跛行或瘫痪等发病症状，各试验组鸭体重与对照组没有显著差异，从关节和肝脏也没有重新分离到接种细菌。

3 讨论

3.1 肉鸭关节炎目前在生产中较为常见，种鸭发病率较高，病鸭多表现跗关节或指关节等处肿胀，剖检可见肌腱肿胀、出血，关节腔内有积液，甚至有干酪样物，有的病例可见关节软骨坏死。同时，病鸭经常伴有肝脾肿大，心肌出血，气囊炎和肠炎等内脏病变。一般认为，肉鸭关节炎多由细菌感染引起，病原包括金黄色葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和链球菌等。但是，从本文的分离情况来看，除大肠杆菌以外，其他致病菌并未分离到，说明这些细菌并不是本文病例的致病因素，反而其他葡萄球菌和某些棒状杆菌分离率较高。本文分离到的葡萄球菌包括松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）、 阿 尔 莱 特 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus arlettae）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii），棒状杆菌包括停滞棒状杆菌（Corynebacterium stationis）、乳酪棒状杆 菌 （Corynebacterium casei）和 （Corynebacterium falsenii）。松鼠葡萄球菌在人、畜以及水生动物身上均能发现，且能够造成人尿路感染、脑膜炎和猪皮炎、山羊淋巴结炎等病症[4-8]。 赵红利、杨军等[9，10]报道从鸭分离到金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、科氏葡萄球菌、伪中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌、溶血葡萄球菌和阿涅蒂斯葡萄球菌等共8种葡萄球菌，其中金黄色葡萄球菌对鸭致病力最强，可以造成多数试验鸭发病死亡，其他葡萄球菌仅造成短期食欲和饮水量下降，而无明显发病症状。木糖葡萄球菌和阿尔莱特葡萄球菌能够造成人和动物的化脓性感染或慢性感染，但未见在鸭上的分离报道[11-14]。

棒状杆菌是人和动物皮肤、粘膜等处的常在寄生菌，除少数成员如白喉棒状杆菌以外，其他一般被认为是条件性致病菌[15，16]，对于羊、猪等动物而言，某些棒状杆菌可以造成淋巴结肿大以及内脏的出血和化脓症状[17，18]。棒状杆菌在自然环境中分布较为广泛，在鸡、鸭等家禽肠道、粪便及禽舍中也能够分离到[19-21]，Mohan等[22]曾报道从多发性关节炎病鸡中分离到疑似棒状杆菌，但未见鸭感染棒状杆菌的报道。

除以上葡萄球菌、棒状杆菌和部分大肠杆菌以外，我们还分离到一株Jeotgalicoccus schoeneichii，该菌为革兰氏阳性，不运动，不形成芽孢的球菌，Glaeser等[23]报道曾从猪舍的废气中分离到该菌，可能是环境中的常在细菌。肉鸭关节炎病因较为复杂，除细菌性因素外，其他病原如呼肠孤病毒、支原体以及霉菌毒素等也可能造成发病。虽然动物试验显示以上分离菌单独对鸭没有致病作用，但这些细菌作为条件性致病菌，在应激、霉菌毒素中毒或其他病原混合感染的情况下，有可能作为协同因素使病情更加严重。

3.2 由于我国家禽养殖业是从低水平粗放型养殖模式逐步发展而来，从业者为了预防和控制各类疫病而频繁大量使用药物，造成细菌性病原耐药性严重。从表2可以看出，23个菌株针对供试药物具有不同程度的耐药性，其中对氟苯尼考具有耐药性的有18个菌株，对强力霉素和恩诺沙星具有耐药性的各有15个菌株，对阿奇霉素具有耐药性的有12个菌株，抑菌效果相对较好的药物是头孢噻肟和阿米卡星，各有4个和2个耐药菌株，抑菌效果最好的药物是阿莫西林，对所有分离菌株均在中敏以上。耐药性最强的分离菌株为Jeotgalicoccusschoeneichii，该菌对供试的7种药物中的6种均不敏感。虽然细菌耐药性和致病性之间并不存在直接联系，但耐药性会增强细菌的适应性，引起更加严重的感染，提高治疗的难度和成本，还有可能通过食物链传递给人，造成公共卫生隐患。家禽养殖场中细菌耐药性的形成无疑与药物的滥用有关，为了解决这个问题，除了有选择地合理用药以外，还应当积极改变养殖模式，通过卫生和消毒措施减少细菌性病原的感染几率。

3.3 细菌核糖体RNA亚基按照沉降系数分为5S、16S和23S三种，16S rDNA是编码16S亚基的基因，该基因序列中具有多个保守区和可变区，可以根据保守区域设计出针对所有细菌的通用引物，又可以根据可变区的差异区分不同种属的细菌，因此16SrDNA作为一种有效的分子标记，逐步被应用到细菌的分类鉴定和遗传分析中。通过对16S rDNA的PCR扩增、序列测定和比对即可确定细菌分类地位，特别是对于一些难以分离和纯化的细菌而言，相对于生化试验耗时较长、工作量较大的缺陷，这种方法具有无可比拟的优势。但部分细菌由于种间差异较小，仅仅利用16S rDNA测序不能鉴定到种，这种情况下仍需要利用生化试验或16S～23S rDNA间隔序列分析进行确定。本文利用16S rDNA分析鉴定了23株鸭源分离菌，与GenBank中相近菌株的同源性为88%～100%，说明本方法可用于快速确定细菌的属种，是细菌学分析的有力工具。