基于转录组学筛选与哺乳动物睾丸发育相关基因及调控网络的研究进展

孙 武，罗 静， 李发弟，2，李万宏，乐祥鹏*

(1. 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室,兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室,兰州大学草地农业科技学院,兰州 730020； 2. 甘肃省肉羊繁育生物技术工程实验室，民勤 733300)

睾丸作为雄性哺乳动物特有的生殖器官，具有生成精子、分泌雄性激素等重要功能，其正常的结构和生理机能是繁殖活动的基础。此外，公畜睾丸大小，一般以阴囊周长(scrotal circumference，SC)来表示，因其测量简单，遗传力高，选择效果好等优点成为遗传改良公畜及其半同胞母畜的一个重要指标[1-3]。在不同的哺乳动物中，均发现睾丸大小与射精量、精子密度、精子活力等呈显著正相关，与精子畸形率紧密负相关[1, 4-5]。鉴于睾丸大小的遗传力高达0.67[6]，因此通过睾丸大小对种公畜进行选择被认为是遗传改良群体固有繁殖力最快和最有效的方法。睾丸的发育是一个高度复杂而精密的过程，涉及生殖细胞的增殖分化、支持细胞和间质细胞的发育与成熟等[7]，成为动物繁殖学领域的一项重大课题。

近些年来，随着生物科学技术的不断进步，各种组学技术日新月异，以mRNA、miRNA、lncRNA、piRNA等为主的转录组学研究得到了广泛关注。研究证实它们在机体生长、发育和凋亡等过程中具有重要的调控意义[8]。同机体其它器官和组织一样，睾丸的正常发育和精子生成也会受到蛋白编码基因和非编码RNA的严格调控。目前，哺乳动物睾丸发育相关mRNA、miRNA、lncRNA和piRNA等为主的测序以及对睾丸发育精子生成起调控作用的分子功能研究已经被广泛报道。本文综述了近年来睾丸发育相关mRNA、miRNA、lncRNA和piRNA等的研究进展，以期为后续科学研究以及生产实践提供参考和理论依据。

1 睾丸发育过程mRNA的鉴定及差异表达研究

揭示哺乳动物睾丸发育机制首要工作是得到其完整的睾丸mRNA表达谱。近几年来，RNA-seq技术的发展对揭示各种生物发育过程mRNA的动态变化机制十分奏效，尤其是哺乳动物睾丸发育的研究。睾丸发育过程mRNA表达谱的鉴定主要集中于小鼠、人类、猪、牛。睾丸发育过程中比较重要的两个阶段是性成熟前包括胎儿期、幼年期和性成熟后[9]。性成熟前，睾丸组织的支持细胞、间质细胞和生精细胞都处于快速增殖分化状态，而性成熟之后增殖状态进入平台期。Gong等[10]对6日龄、4周龄和10周龄小鼠睾丸组织进行RNA-seq研究，鉴定出18 837个基因，并且幼龄期睾丸基因表达模式显著的区别于性成熟期和成年期，发现绝大部分差异表达基因均与睾丸发育及精子发生相关，其中筛选到的差异表达基因VIM(vimentin)随着发育阶段的推后表达量逐步降低，在小鼠、猪、人等物种中都发现类似的结论。该基因属于支持细胞与间质细胞的细胞骨架成分，故推测其参与支持细胞-生精细胞间的物质和信息交流，对精子发生及维持支持细胞形态起重要作用[11]。在4周龄小鼠睾丸中超高表达的INSL3 (insulin-like factor 3)，是间质细胞产生的一种激素，与睾丸引带发育和睾丸下降有关[12]。Pitia等[13]以牛、绵羊和山羊为研究对象，进一步探讨INSL3基因对睾丸发育以及精子功能的影响，结果表明，正常公牛睾丸INSL3的表达水平显著高于低繁殖力公牛(P<0.05)，并且通过HE染色进一步发现其在低繁殖力公牛精母细胞中表达水平显著低于高繁殖力公牛(P<0.05)。这些证据表明，INSL3可以作为早期公畜选择的候选基因。Ran等[14]分别对60和90胚龄猪胚胎、产后30和180日龄猪的睾丸组织进行RNA-Seq分析，鉴定出8 343个差异表达基因，通过GO富集分析得到了与睾丸发育相关的重要候选基因(SOX9、GATA4、FOG2、INHBA、Sry、SPAG6、RanBP9、TGF-β家族)以及调控睾丸发育、精子生成的一些重要通路(MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin、PI3K-Akt)。Song等[15]对产后60和180日龄大白猪的睾丸组织进行RNA-seq，鉴定出242个参与精子发生的关键基因，包括PIWIL、SPATA、KIT、INHBA、SPAG6、RanBP9等。大量研究证实[16]，INHBA基因在性成熟前表达量显著地高于性成熟后，并且对生殖细胞和间质细胞的物质交流很重要。Parker等[17]利用GWAS方法揭示INHBA基因的一个SNP(rs6279141)与小鼠睾丸重量显著关联(P=4.51×10-18)，推测该基因可以显著影响小鼠睾丸形态发生，睾丸细胞增殖和睾丸重量。这些研究暗示，INHBA基因可能是决定睾丸发育的重要候选分子。RanBP9基因对雄性生殖细胞发育和雄性生育能力有重要作用[18]。将RanBP9敲除后，RanBP9-/-雄性小鼠在发育过程中出现精原细胞的增殖能力显著下降、生精小管管腔变小、生殖细胞迅速减少甚至消失等现象。

Li等[19]利用高通量测序技术(next generation sequencing, NGS)对两个猪品种性成熟前后的睾丸组织进行转录组测序，得到了许多决定睾丸发育以及精子发生的候选基因，比如SMAD4、c-kit、GPR54等。SMAD4基因通过调节间质细胞和支持细胞的增殖分化进而调控公畜的生殖系统。c-kit作为生精过程中重要的信号传递受体，对生殖细胞(germ cell，GC)的存活、迁移和精原细胞的维持及分化起关键作用[20]。GPR54参与下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary gland axis，HPG)生殖调控，通过GnRH调控LH和FSH水平。GPR54基因敲除雄性小鼠表现出睾丸和阴茎不能正常发育，并且不能产生精子，由此推测，GPR54缺失和突变切断了GnRH的脉冲性释放，进而导致动物生殖功能的丧失[21]。

钟金城等[22]通过RNA-seq对犏牛和牦牛睾丸组织做了比较研究，分别获得18 529和17 784个蛋白编码基因，其中共表达基因17 120个，新基因478个，同样发现差异表达的基因均与精子发生相关，包括SPEF2、MBL2等。郭芳等[23]研究表明，SPEF2在初生和成年公牛睾丸组织中差异表达，并且其可变剪切体和功能性SNP位点与公牛精液品质密切相关。白井岩等[24]发现，公牛MBL2基因多态性与精液品质及后裔生产性能有显著关联性。同时，将牦牛和犏牛睾丸组织中获得的差异表达基因进行KEGG分析发现，32条显著富集的代谢通路(P< 0.01)，几乎全部通路均与睾丸发育过程密切相关[22]。Chang等[25]对牛20日龄、8月龄、2周岁的睾丸组织进行NGS测序，在Y染色体雄性特异区鉴定到1 274个差异表达转录本，并呈现不同的表达模式，表明Y染色体基因可能在睾丸的发育和雄性繁殖力上起关键作用。以上研究表明，哺乳动物睾丸发育过程存在许多差异表达基因，并且它们存在阶段依赖性，蛋白编码基因可以通过多种作用方式对睾丸发育起到关键的调控作用，通过一些遗传变异，包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)、拷贝数变异(copy number variations, CNVs)、插入缺失(insert and deletion, Indel)影响基因表达，进而影响了睾丸发育过程以及精子生成过程，这种调控作用在物种之间可能具有差异性，其原因推测，可能与哺乳动物的驯化、迁徙、基因渗透、生存环境显著相关。

2 睾丸发育过程miRNA的鉴定及调控

microRNA是一种内源性的非编码小RNA，通常与靶基因的3′UTR、CDS和5′UTR相结合来负调节靶基因的转录[26-29]。miRNA在不同哺乳动物睾丸发育及精子发生过程中扮演重要角色，并且其表达还具有种属特异性和时间特异性。Sree等[30]对8、16、24日龄小鼠睾丸组织进行NGS测序，并且构建miRNA-mRNA调控网络，找到一些枢纽miRNA，如miR-34c、miR-221、miR-222、miR-20和miR-106a等。研究发现，miR-34c主要表达于粗线期精母细胞和圆形精子细胞，并且可以和精子发生重要转录因子TGIF2和NOTCH2互作，共同调控精子发生的进程[31]。因此，推测miR-34c是精子发生的一个关键调节器，miR-34c能够下调p53通路下游RARG、STRA8与c-MYC的表达，进而抑制奶山羊雄性生殖干细胞的增殖[32-33]。miR-221和miR-222在转录后水平负调控c-kit的表达，同时miR-221和miR-222过表达会诱导未分化的精原干细胞转变为c-kit阳性分化的精原细胞[34]。miR-20和miR-106a存在于精原干细胞(spermatogonial stem cell, SSC)，并且通过在转录后水平靶向STAT3和Ccnd1参与SSC自我更新和精原细胞的分化[35]。

在猪上，Huang等[36]发现miR-375和miR-499在军牧1号白猪1和6月龄睾丸组织存在差异表达；进一步通过双荧光素酶报告基因法、实时荧光定量和蛋白免疫印迹等方法发现miR-375和miR-499可分别负向调控靶基因DIAPH2和QKI[37-38]，结合睾丸组织发育HE染色切片，推测不同发育阶段的miR-375/499及其各自的靶基因的差异表达可能和睾丸组织发育程度有关。随后，许多学者在不同发育阶段猪睾丸组织中鉴定到大批差异表达mRNA和miRNA，并通过构建miRNA-mRNA互作调控网路筛选出了许多核心miRNA，包括miR-18、miR-21、miR-135a 等[14, 39-40]。miR-18在精子发生过程中以热休克因子2(heat shock factor 2，HSF2)为靶目标，而HSF2是一个广泛影响发育过程的重要转录因子；输精管中miR-18下调会增加HSF2 mRNA的表达，进而改变HSF2蛋白表达水平[41]。miR-135a和miR-21可以分别通过靶向FoxO1和ETV5，从而促进SSC的增值和维持SSC数量[42-43]。

廖珂[44]进行牦牛、普通牛、犏牛睾丸组织的miRNA鉴定及生物学功能研究发现，差异表达miRNA(bta-miR-125a、bta-miR-125b、bta-miR-26a、bta-miR-26b)调控的靶基因涉及细胞凋亡机制，可能与犏牛精子发生阻滞相关。综上所述，miRNA表达模式在哺乳动物体内是固定的，但由于物种、组织的不同，这种固定表达模式也随之变化；miRNA表达谱鉴定以及miRNA与mRNA调控网络的互作分析对于解析哺乳动物的睾丸发育以及精子发生过程遗传机制提供了一定的理论基础。

3 睾丸发育过程lncRNA的鉴定及调控

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度>200 nt的非编码RNA，其来源于基因组，并且占有很大的比例，是最近几年研究的一个热点[45]。LncRNA在睾丸发育和雄性生殖细胞增殖中起到很重要的作用。Nishant等[46]发现了一个长度为2.4 kb的Mrhl-lncRNA，其在小鼠GC1期精原细胞的核仁中特异性表达，通过与p68蛋白相互作用阻断Wnt信号通路，从而调控精子发生过程。Anguera等[47]发现，Tsx-lncRNA在粗线期精母细胞中特异性表达，暗示Tsx在生殖细胞减数分裂起调节作用。Sun等[48]以6日龄和8周龄小鼠的睾丸组织为研究对象，筛选出8 265个lncRNA，其中3 025个差异表达。同时，发现大量lncRNA(Ovol1、Ovol2、Lhx1、Sox3、Sox9、Plzf、c-Kit、Wt1、Sycp2、Prm1和Prm2)跟一些关键转录因子相互毗邻，共同参与精子发生过程。

Ran等[49]对猪30和180日龄的睾丸组织进行了lncRNA测序，共鉴定出777个lncRNA，其中735个为共有lncRNA，并且筛选到101个差异表达lncRNA，其中，20个在幼年睾丸特异性表达，22个在成年睾丸中特异性表达；33个GO条目和7个通路被显著富集，主要通路有TNF、AMPK和Estrogen。韩聪[50]发现，幼龄陕北白绒山羊睾丸组织lncRNA表达显著区别于性成熟期和成年期，差异表达的lncRNA可能通过各种途径调控生精细胞的发育。综上， lncRNA作为一种调节分子已证实与机体发育[51-52]、X染色体失活[53-54]、基因组印记[55]及疾病[56-57]等方面至关重要，但它到底是如何调控哺乳动物睾丸的发育，还有待进一步深入研究，因此阐明lncRNA对睾丸组织发育及精子生成过程的影响对分子育种具有重要科学意义。

4 睾丸发育过程piRNA的鉴定及调控

piRNA是一类特异性在动物生殖细胞中表达的非编码小分子RNA，和Piwi蛋白特异性结合在一起，参与生殖干细胞和生殖细胞发育的调控[58]。在精子发生的各个不同阶段，该分子通过与PIWI亚家族蛋白的3个成员偶联发挥其调控作用。piRNA分子首次在小鼠睾丸组织被发现，后续在人、大鼠、猪、马等[59]哺乳动物中也发现了piRNA的存在。Yang等[60]在正常人睾丸组织中鉴定到20 121个piRNA，其序列的来源基因包含TDRG1和CYP19A1。TDRG1属于睾丸特异性表达基因，阶段性的调控精子发生进程[61]；CYP19A1是将雄激素转化为雌激素的关键酶，也是性别分化相关miRNAs的一个重要潜在靶基因[62]。

相关研究分别对性成熟前后猪睾丸组织的差异piRNA进行了鉴定，发现它们毗邻的mRNA都参与精子发生、能量代谢、细胞生长调节、细胞黏附、信号转导、细胞-细胞连接等繁殖相关的生物学过程，证实了piRNA对睾丸发育及精子发生有调控作用[63-64]。此外道楞[65]对性成熟前后蒙古马睾丸组织进行NGS发现，性成熟前睾丸组织比性成熟后睾丸组织piRNA的种类更加丰富，这一结论与小鼠[66]、人[60]、猪[19]等物种上的报道相似，暗示piRNA在哺乳动物睾丸发育以及精子发生过程中扮演着重要角色。此外，道楞[65]获得的差异表达piRNA来源基因包含PIWIL1和PIWIL2，其中PIWIL1和piRNA 在马睾丸中的表达量随着个体的发育而增加，在狗中也发现相同的结果[67]。PIWIL1基因是在人中最早发现在睾丸组织特异性表达的PIWI家族蛋白，已经在人、恒河猴等物种中证实，在精母细胞和成熟精子中高表达，并阶段性调控生精过程[68]。因此可推测,piRNA与PIWI同源蛋白PIWIL1相互作用共同调控精子的发生过程。PIWIL2参与维持生殖干细胞自我更新、甲基化介导转座子抑制、染色质重组等生物过程，并在piRNA的前体起源及转录调控中发挥着重要作用。顾垚[69]研究表明，PIWIL2基因在黄牛和牦牛睾丸组织中特异性表达，并且该基因5′UTR区域的甲基化状态与犏牛精子发生障碍、雄性不育密切相关。

由于piRNA在雄性生殖系统中起着多种重要的作用，被视为哺乳动物生殖系统发育的关键调控因子之一，随着研究的不断深入，越来越多的证据显示，piRNA以多种不同机制参与精子发生相关基因的表达调控，为人们深入理解哺乳动物睾丸发育和精子发生的分子机制及调控网络提供了一个很好的视角。

5 存在的问题与展望

5.1 存在的问题

本文综述了睾丸发育的转录组学研究进展，包括睾丸发育相关mRNA、miRNA、lncRNA、piRNA。转录组学在动物睾丸发育以及精子发生中取得了很大的进展，但目前的研究仍然存在一定的局限性。1)mRNA、miRNA、lncRNA、piRNA组学的研究比较独立，没有得到有效的整合分析，使得大量的测序数据没有得到有效利用。2)目前，哺乳动物Y染色体鉴定的基因很有限，主要是Y染色体大量的重复序列导致测序难度很大；3)研究主要集中在人以及小鼠、猪等模式动物，而对于驯化家畜睾丸转录组学的研究很有限；4)利用NGS技术确实筛选到了许多差异基因、差异miRNA、差异lncRNA、差异piRNA，但是对这些候选分子的功能验证还很有限。需进一步对候选分子进行后功能基因组组学研究，筛选出睾丸发育相关候选分子，并在细胞水平或结合体内、体外验证试验，从而较全面的、精确地解析候选基因对睾丸发育的调控过程。

5.2 展望

睾丸的正常发育对哺乳动物繁殖力的提高和优良种公畜精液的充分利用具有十分重要的作用。睾丸发育过程极其复杂，受到遗传因素和环境因素共同作用。特异性表达mRNA、miRNA、lncRNA、piRNA在睾丸组织发育和精子生成的各个阶段均发挥重要作用，因此，对这些调控分子的研究意义重大。

睾丸发育研究作为生物繁殖学领域的重要课题。通过对睾丸发育转录组学的研究，探讨特异性表达基因与睾丸发育的相关性，极大地提高了人们对睾丸发育、生精过程等重要生理过程的认识，可以更全面地了解睾丸发育过程中重要基因的表达模式、转录因子及RNA结合蛋白活化模式及激素调节方式，一方面，可以为探索人以及犏牛等哺乳动物雄性不育、睾丸发育不完全综合征等疾病的遗传机制奠定理论基础，另一方面，对于牛、羊、猪等优秀种公畜的早期选育提供一定的理论参考依据。