亚硫酸钠辅助酶解蛋壳膜制备抗氧化多肽的工艺

赵婕媛，李晓云，黄茜

（华中农业大学食品科技学院，蛋品加工技术国家地方联合工程中心，农业农村部蛋品加工重点实验室，湖北武汉 430070）

生物活性肽是来自蛋白质水解产物由 2～20个氨基酸组成的短肽。这些肽对于人体健康方面有很多积极作用，如抗氧化活性，抗菌性，血管紧张素转换酶（ACE）抑制作用和免疫调节作用等，当前，生物活性肽被广泛应用于化妆品，食品添加剂，营养品和药物等[1]。抗氧化肽像其他抗氧化剂一样，可以保护机体免受由羟自由基，超氧化物，过氧化氢，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）自由基引起的损伤[2]，抑制脂质过氧化[3]。抗氧化肽也可以应用于保护食品，减少食品由氧化引起的变色和变质。与合成抗氧化剂相比，来自食品资源的抗氧化肽有易吸收，无毒副作用的优点。目前，一些用作食品添加剂的合成抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚和丁基羟基甲苯因其毒性而开始受到限制[4]。因此，利用可行和高效的方法从自然资源获得无毒的抗氧化剂用于替代合成抗氧化剂的食品添加剂具有非常重要的意义。

近年来，从天然来源寻找新的抗氧化剂用于取代食品和药物材料中的合成抗氧化剂引起研究者极大的兴趣。研究发现，天然存在于水果、蔬菜、种子中的维生素C、α生育酚和酚类化合物[5]等具有减少氧化损伤的能力，氧化损伤与癌症、心血管疾病和动脉粥样硬化等疾病有关。研究发现，许多来源于植物蛋白或者动物蛋白的蛋白水解物具有抗氧化活性，例如大豆蛋白[6]、米糠蛋白[7]、蛋黄蛋白[8]和猪肌原纤维蛋白[9]等。此外，水产品和副产品也是抗氧化肽的良好来源，例如海参[10]、沙丁鱼副产物[4]。

近年来中国禽蛋产量逐年增长，2016年全国禽蛋产量 3095万吨[11]。在禽蛋生产和消费过程中，禽蛋壳膜大量产生，按蛋壳膜重占蛋重的1.02%计算[12]，我国每年有31.57万吨废弃蛋壳膜产生，并且禽蛋壳膜主要作为废弃物处理，造成了资源浪费和环境污染。蛋壳膜含有丰富的蛋白质，如胶原蛋白（I型，V型和X型）、骨桥蛋白、唾液蛋白、角蛋白、卵清蛋白等[13]，此外还含有约3%的脂质体和2%的糖类。国内外对蛋壳膜蛋白及多肽的研究越来越多，研究发现蛋壳膜作为一种新型膳食补充剂，临床上已显示缓解关节炎关节疼痛和僵硬[14]，研究发现蛋壳膜的酶解产物的活性强于原蛋白，酶解产物具有清除 O2-·、OH·等自由基的活性，并且对DNA损伤有保护作用[15]，有研究利用蛋壳膜水解物制作化妆品[16]，因此蛋壳膜酶解物具有作为抗氧化食品添加剂、抗氧化化妆品的潜力，蛋壳膜具有高价值利用的潜力。因此采用适当方式将禽蛋壳加工成具有商业价值的产品，是提高禽蛋综合价值，减少环境污染的有效途径。本文旨在研究亚硫酸钠辅助蛋白酶酶解蛋白酶制备具有高抗氧化活性的蛋壳膜多肽，以其为蛋壳膜产品的开发和应用提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

鸡蛋壳膜，采购于黑龙江中农兴和生物科技有限公司。

碱性蛋白酶（2×105U/g）、胃蛋白酶（3×106U/g），neofroxx公司；木瓜蛋白酶（8×105U/g）、中性蛋白酶（1×105U/g）、胰凝乳蛋白酶（1.5×106U/g），上海源叶生物有限公司；SDS-PAGE试剂盒、Tricine-SDS-PAGE试剂盒、预染超低分子量蛋白质Marker（3.3 ku～31.0 ku），北京索莱宝科技有限公司；Fermentas预染蛋白Marker 10～250 ku，北京明阳科华生物科技有限公司；亚硫酸钠、浓硫酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、钼酸铵、磷酸钠、甲醛等均为分析纯，国药集团试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Sigma3-30K高速冷冻离心机，美国Sigma公司；K9840半自动凯氏定氮仪，济南华舜仪器有限公司；LSHZ-300全温振荡箱，苏州培英实验设备有限公司；HYP-308消化炉，上海纤检仪器有限公司；Nanodrop 2000C紫外分光光度计，Thermo Fisher Scientific公司；Heidolph真空冷冻干燥机，Germany公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

鸡蛋壳膜→加酶、亚硫酸钠→恒温震荡水浴酶解→灭酶（80 ℃，20 min）→离心（3600 g，10 min）→上清液→透析→冷冻干燥→蛋壳膜酶解物

1.3.2 单因素实验

1.3.2.1 酶的筛选

准确称取5.000 g的鸡蛋壳膜粉，按1：20的料液比加入30 mM的亚硫酸钠溶液配置成鸡蛋壳膜悬浊液，用1 M NaOH或1 M HCl调节pH至所用酶的最适pH，按9 U/mg的酶与底物蛋壳膜比分别加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶，再在各个酶的最适温度下持续震荡6 h（胃蛋白酶采用pH为2.0，酶解温度37 ℃，木瓜蛋白酶采用pH为6.5，酶解温度60 ℃，糜蛋白酶采用pH 7.9，酶解温度37 ℃，碱性蛋白酶采用pH为8.0，酶解温度55 ℃，中性蛋白酶采用pH为7.5，酶解温度45 ℃），取出，离心（3600 g，10 min），取部分上清液测定水解度。其余上清液使用截留分子量为1 ku的透析袋在4 ℃下透析24 h，冷冻干燥。以水解度和总抗氧化能力为指标确定鸡蛋壳膜酶解最佳用酶。

1.3.2.2 加酶量的确定

在确定蛋白酶的基础上，料液比、亚硫酸钠浓度、酶解时间分别固定为1：20、30 mM、6 h，按3 U/mg、6 U/mg、9 U/mg、12 U/mg、15 U/mg的加酶量加入碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶，以水解度和总抗氧化能力为指标，确定最优的加酶量。

1.3.2.3 亚硫酸钠浓度的确定

碱性蛋白酶加酶量为12 U/mg，料液比、酶解时间分别固定为1：20、6 h，亚硫酸钠浓度分别为10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM，以水解度和总抗氧化能力为指标，确定亚硫酸钠最适浓度。

1.3.2.4 酶解时间的确定

碱性蛋白酶加酶量为12 U/mg，料液比为1：20，亚硫酸钠浓度为40 mM，酶解时间分别为2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，以水解度和总抗氧化能力为指标，确定最佳酶解时间。

1.3.3 游离氨基态氮含量测定：甲醛值法

游离氨基态氮含量采用中华人民共和国国家标准GB/T 5009.39-2003氨基态氮甲醛值法测定，实验做三次平行。吸取5 mL样品，加入60 mL蒸馏水，开动磁力搅拌器，用0.050 mol/L NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH 8.2，加入10.0 mL中性甲醛溶液，混匀。再用0.050 mol/L NaOH标准溶液继续滴定至pH 9.2，记下消耗 NaOH标准溶液的体积，记为 V1。同时取65 mL蒸馏水，先用0.050 mol/L NaOH标准溶液调节至pH为8.2，再加入10.0 mL中性甲醛溶液，继续用NaOH滴定至pH 9.2，做为试剂空白试验，记录消耗NaOH的体积，记为V2。试样中氨基酸态氮的含量计算公式：

注：X表示试样中氨基酸态氮的含量，单位为g/mL；V1表示测定试样加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位为mL；V2表示试剂空白实验加入甲醛后消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位为mL；c表示NaOH标准滴定溶液的浓度，单位为mol/L；0.014表示与1 mL 1.000 mol/L NaOH标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为g。

1.3.4 总氮含量测定

本试验采用中华人民共和国国家标准食品中蛋白质的测定GB 5009.5-2016凯氏定氮法测定总氮含量。

1.3.5 水解度测定

根据文献[17]的方法，实验做三次平行。

1.3.6 总抗氧化能力测定

蛋壳膜肽总抗氧化能力是参照Huang Y等[18]人的研究方法进行测定的。方法如下：将蛋壳膜多肽配置成3 mg/mL的溶液，各取0.1 mL于10 mL的具塞试管中，加入5 mL配置好的试剂（4 mmol/L钼酸铵、28 mmol/L磷酸钠和0.6 mol/L浓硫酸），混匀，密封置于95 ℃的恒温水浴锅中反应90 min，取出后迅速冷却至 25 ℃室温，使用紫外分光光度计测定波长为695 nm处的吸光值（A695nm），以等体积的去离子水代替样品溶液作为空白对照。同时用抗坏血酸溶液（0，100，200，300，400 μg/mL）作阳性对照，蛋白质水解物溶液的总抗氧化活性（TAA）表示为相当于抗坏血酸的量，实验做三次平行。

1.3.7 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

按照SDS-PAGE试剂盒说明书操作，简言之，将蛋壳膜水解产物以1：4比例与上样缓冲液混合。为了使蛋白质变性，将溶液煮沸 5 min，然后用于SDS-PAGE。样品在80 V的叠加电压和100 V的分辨电压下进行SDS-PAGE。考马斯亮蓝G-250用作染色液。

为了进一步确定蛋壳膜水解物在15 ku以下的分子量分布，进行了小分量电泳，按照Tricine-SDS-PAGE试剂盒说明书操作，使用16.5%的Tricine-SDS-PAGE凝胶对蛋壳膜多肽进行电泳，电泳结束后使用考马斯亮蓝G-250进行染色，分析。

1.3.8 数据分析

所有实验进行 3次重复，单因素实验数据采用SPSS 17.0软件进行One-way ANOVA分析，平均值之间用Duncan’s multiple range test进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 酶种类对蛋壳膜蛋白水解度和总抗氧化能力的影响

图1 不同种类的蛋白酶对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响Fig.1 Effect of different kinds of proteases on total antioxidant activity and hydrolysis degree of eggshell membrane

母相同表示差异不显著(p＞0.05)；字母不同表示差异显著(p＜0.05)。

如图1，对照组的水解度都在1%左右，说明水解蛋壳膜蛋白起主要作用的是蛋白酶。因为大多数酶酶解时有特异性切割位点，因此使用不同的酶可以生成具有不同氨基酸序列的多肽，同时酶的种类也可以影响多肽的生物活性和消化速度[19]。如图1所示，五种酶中，碱性蛋白酶酶解产物的水解度显著高于其它四种酶的酶解产物，最高达10.85%，与尤娟用蛋白酶酶解鲢鱼鱼肉蛋白得到的结果相似[20]，碱性蛋白酶酶解得到的水解度最大，其它四种蛋白酶的水解度在2.68%～7.89%。酶解产物的抗氧化活性从高到低依次是：碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞糜蛋白酶＞胃蛋白酶。木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解产物抗氧化活性最高，显著高于其它三种酶的酶解产物（p＜0.05），总抗氧化能力分别为 198.00 μg/mL 和218.61 μg/mL，所以本实验选择木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。这与周艳华用蛋白酶酶解蛋壳膜蛋白得到的结果相似[17]，都是碱性蛋白酶的酶解产物抗氧化活性较好，这可能是因为碱性蛋白酶酶解物的水解度较高，生成了具有更高抗氧化活性的短肽。

2.2 木瓜蛋白酶加酶量对蛋壳膜多肽水解度和总抗氧化能力的影响

图2 木瓜蛋白酶加酶量对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响Fig.2 Effect of papain dosage on total antioxidant activity and degree of hydrolysis of eggshell membrane

酶解速度取决于加酶量，少量的酶不能完全酶解底物蛋白，如图2所示，底物浓度不变，木瓜蛋白酶加酶量在0 U/mg～9 U/mg范围内，酶解物水解度随加酶量增高呈快速上升趋势。当加酶量达到9 U/mg后，水解度上升趋势变缓，在 15 U/mg时达到最大值8.94%。木瓜蛋白酶加酶量在0 U/mg～12 U/mg范围内，随木瓜蛋白酶加酶量的升高，总抗氧化能力呈现上升趋势。当加酶量增高到12 U/mg时，总抗氧能力达到最大值为205.58 μg/mL，加酶量继续增加到15 U/mg时，此时水解度继续上升但总抗氧化能力出现下降，可能是木瓜蛋白酶继续酶解，将抗氧化多肽酶解呈没有抗氧化活性的肽段。

2.3 碱性蛋白酶加酶量对蛋壳膜多肽水解度和总抗氧化能力的影响

图3 碱性蛋白酶加酶量对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响Fig.3 Effects of alkaline protease dosage on total antioxidant activity and degree of hydrolysis of eggshell membrane

如图3所示，随着加酶量的升高，酶解产物的水解度和总抗氧化能力逐渐上升，这是因为当底物浓度不变时，增加加酶量，增高了蛋白酶与底物接触的机会[21]，底物被酶解的越充分生成的抗氧化活性肽量越多，因此水解度和酶解物的总抗氧化能力升高。当加酶量达到6 U/mg后，水解度趋于平稳，这可能是因为底物蛋白浓度一定，加酶量超过一定量之后达到饱和[22]。加酶量为12 U/mg时，总抗氧化能力达到最大值230.73 μg/mL，显著高于木瓜蛋白酶加酶量12 U/mg时的酶解物的总抗氧化能力，碱性蛋白酶加酶量增高到12 U/mg之后，总抗氧化能力略微下降，因此本实验选择碱性蛋白酶加酶量为12 U/mg。

2.4 Na2SO3浓度对蛋壳膜多肽水解度和总抗氧化能力的影响

如图4所示，Na2SO3浓度在0～30 mM范围内，水解度随 Na2SO3浓度升高呈上升趋势，这表明低浓度Na2SO3有利于蛋壳膜酶解，与Hamada[23]研究结果一致。因为蛋壳膜蛋白中含有大量的二硫键，使得蛋白质结构紧密而难以被酶解[12]，Na2SO3可以断裂二硫键[24]，使蛋白质更易与蛋白酶接触，有利于蛋白质与蛋白酶之间相互作用，从而加速酶解。超过30 mM之后水解度呈下降趋势，这可能是因为高浓度的亚硫酸钠抑制了碱性蛋白酶的活性。Na2SO3浓度在0～40 mM范围内，总抗氧化能力随 Na2SO3浓度升高呈上升趋势，在40 mM时达到最大值238.61 μg/mL，超过40 mM之后总抗氧化能力下降，因此本实验选择40 mM的Na2SO3浓度，少量Na2SO3可以通过透析、超滤等方法去除。

图4 Na2SO3浓度对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响Fig.4 Effect of sodium sulfite concentration on total antioxidant activity and hydrolysis degree of eggshell membrane

2.5 酶解时间对蛋壳膜多肽水解度和总抗氧化能力的影响

图5 时间对蛋壳膜总抗氧化活性和水解度的影响Fig.5 Effect of time on total antioxidant activity and hydrolysis degree of eggshell membrane

图5是碱性蛋白酶酶解时间对酶解产物水解度和总抗氧化能力的影响。可以看出，随着酶解时间延长，禽蛋壳膜的水解度上升趋势显著，水解6 h水解度达到最大值11.29%，超过6 h后，其水解度没有显著性差异（p＞0.05）。可能是因为最初底物浓度较高，酶与底物充分接触，随着水解时间延长，底物浓度降低，产物浓度升高，底物可水解位点的减少和产物的增多抑制了蛋白酶[25]。总抗氧化能力随着酶解时间的延长呈现先上升后下降的趋势，在4 h时达到最大值245.88 μg/mL，这可能时因为初始阶段禽蛋壳膜水解迅速，大量的肽键被水解，使得总抗氧化能力升高[26]，水解度对酶解产物的总抗氧化能力影响显著，因为水解度显著影响肽链长度和产物的末端氨基酸残基[27]，酶解时间延长，水解度先上升后趋于平稳，水解度升高，可能导致多肽被进一步水解成不具有抗化活性的短肽或者氨基酸，因此导致总抗氧化能力下降，本实验选择酶解时间4 h。

2.6 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

图6 不同样品的SDS-PAGE图Fig.6 SDS-PAGE iamge of different samples

如图6所示，Na2SO3处理组产物的分子量明显高于加酶组，在130 ku附近有条带，推测是胶原蛋白的α链，在250 ku附近的条带推测是胶原蛋白的β链，在35～55 ku之间的条带推测是酶解后的角蛋白。碱性蛋白酶在25 ku附近和低于10 ku出现条带。碱性蛋白酶处理组分子量明显低于Na2SO3处理组，在25 ku附近和10 ku附近有条带。碱性蛋白酶和Na2SO3共同处理组在25 ku以下尤其是10 ku附近的的组分含量明显高于单独碱性蛋白酶处理组和单独Na2SO3处理组。

如图7所示，Na2SO3处理组产物主要分布于大于31 ku的部分，碱性蛋白酶处理组高于31 ku的部分少于Na2SO3处理组，低于14.4 ku的部分少于碱性蛋白酶和Na2SO3共同处理组。碱性蛋白酶在4 ku和31 ku处有两条条带，碱性蛋白酶和 Na2SO3共同处理组产物的分子量主要集中在3.3～14.4 ku。

图7 不同样品的Tricine-SDS-PAGE图Fig.7 Tricine-SDS-PAGE iamge of different samples

3 结论

3.1 本研究以绿色安全高效的 Na2SO3辅助生物酶解的方法，通过单因素实验优化了酶解条件，即采用12 U/mg碱性蛋白酶联合40 mM Na2SO3酶解4 h，产物的水解度为8.58%，总抗氧化能力达到245.88 μg/mL，具有较好的抗氧化能力。

3.2 采用SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE分析酶解产物的分子量分布，发现最优条件的蛋壳膜酶解产物的分子量分布在3.3～14.4 ku。为了提高抗氧化肽的纯度以期获得更好的抗氧化活性，本实验后续将进行更深入的研究，具体包括：运用凝胶过滤技术分离纯化酶解产物，对纯化前后多肽的抗氧化活性进行对比等。

3.3 综上，本实验以 Na2SO3辅助碱性蛋白酶酶解的方法，通过酶解条件优化得到了高抗氧化能力的酶解产物，为禽蛋壳膜的深加工利用奠定了理论基础。因此，禽蛋壳膜酶解的蛋壳膜多肽可以作为抗氧化、抗衰老的功能性食品或者化妆品，禽蛋壳膜具有高价值利用的潜力。