银杏浸提液对桃金娘叶绿素荧光和土壤酶活性的影响

黎 舒，郑巧巧，汪凤林，陈潇潇，兰思仁，曹光球

(福建农林大学，福建福州350002)

银杏(Ginkgo biloba)，别名公孙树、白果，属裸子植物门银杏科，雌雄异株，现存 1属1科1种，素有“活化石”、“植物界的大熊猫”称号，是我国特有珍稀树种和优势树种，1984年被列为国家二级保护植物［1-2］。桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)又称山稔、稔子、豆稔等，广泛分布于我国东南部、南部至西南部［3］，在干旱、瘠薄土壤上亦生长良好，是荒山绿化、水土保持的优良树种。

植物化感作用，指的是不同植物(包括微生物)释放出的化学物质引起的相互作用，体现了植物个体及群体之间相克相生的关系［4］，1937年德国科学家H.Molish［5］首次提出化感作用一词，银杏叶和外种皮中含有白果酸、氢化白果酸等多种生物活性物质［6-7］，刘晓平［8］等研究银杏酚酸具有致过敏、致突变作用，具有强烈的杀虫、抗菌、杀菌和抗病毒活性;赵肃清［9］等研究银杏叶和外种皮物质具有一定毒性，银杏外种皮提取液(2.0 mg·mL－1)使盆栽番茄因青枯病导致的死亡率显著降低;张美芳［10］等研究银杏叶提取液可以在一定程度上抑制PPO和POD的活性，有效抑制微生物的生长;秦丹［11］等研究银杏外种皮和银杏叶不同溶剂提取液对松材线虫有抑制作用，以蒸馏水为提取液的外种皮浸提液浓度在20 mg·mL－1时，松材线虫死亡率达到84.9%;陈虹霞［12］等研究低浓度银杏叶聚戊烯醇提取物促进小麦种子萌发和幼苗生长，增强种子淀粉酶活性。

本试验与前人研究方法相同，不同的是研究对象为桃金娘，目前关于银杏套种桃金娘方面的研究在国内鲜见报道。本试验从化感作用的角度揭示桃金娘是否适合在林下种植，以及2种植物种间是否有良好的生化关系，探讨银杏叶和根系分解释放的物质在进入土壤物质循环后，对受体植物桃金娘生长所产生的综合影响如何。本研究采用盆栽试验，以桃金娘为受体，模拟自然界中银杏叶和根在土壤内分解过程中对其生长的影响，以期为银杏叶、根对桃金娘化感作用的深入研究提供参考依据，将对银杏农林复合模式中搭配树种的科学选择具有重要的借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为银杏叶和根，取自福建省龙岩市长汀县策武镇南坑村21年生银杏园，收集银杏叶，取表层土20 cm以下根系，所取样品采用装有冰袋的－4℃便携式保温箱低温保存带回实验室。取完后将土覆盖回原处，避免影响银杏的正常生长;试验受体植物材料为3年生桃金娘，购自沭阳县新泰绿化苗木公司(采用种子播种，大棚规模化种植)。参试桃金娘植株选择生长情况基本一致的健康苗木，平均苗高60～63 cm，平均地径0.9～1.3 cm。选择栽培基质(草炭土 ∶黄壤 ∶细沙为2∶6∶2)将其充分混匀，平铺晾至2 d待用，盆栽试验的栽植容器为上口径27 cm、高20 cm的塑料盆钵，每盆装土7 kg，每盆栽种2株桃金娘。

1.2 方法

1.2.1 银杏叶和根浸提液的制备 采用单因素试验法，将收集的银杏叶和根用清水洗净泥土、晾干、剪碎，随机取100 g放置于烧杯中，加入1 L蒸馏水摇匀用保鲜膜封住瓶口，放置48 h后，用纱布将叶和根系过滤取上清液，配制成0.10 g·mL－1提取液，将提取液放置于4℃冰箱贮存备用。

1.2.2 盆栽试验的布设 以蒸馏水为对照(CK)，将所制得的银杏叶浸提液提取稀释成 0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 g·mL－1不同梯度试验品，标记为试验1～5，银杏根浸提液提取稀释成0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 g·mL－1不同梯度试验品，标记为试验6～10，以蒸馏水为对照(CK)，标记为试验11(表1)。每个浓度梯度试验设置3盆重复，11组试验共33盆。2017年3月10日在福建农林大学科研园区种植试验苗，温室培养温度(20±5)℃，光照强度 300 μmol·m－2·s－1，昼夜光照时间:12 h/12 h。将浸提液从冰箱取出，放置常温后，用银杏叶和根的不同梯度浸提液分别浇灌桃金娘苗木，一次性浇透，之后每3 d浇1次，每盆500 mL，保证土壤含水量在20%～30%。培育期间进行正常的管理培养。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 桃金娘生长量测定时间 处理前(3月10日)测定桃金娘苗高和地径，处理3个月后(2017年6月10日)，测定其苗高和地径。

1.2.3.2 桃金娘生长量测定 采用游标卡尺测量桃金娘苗高和地径(苗高测量精度±3.50 cm;地径测量精度±0.20 cm)。

1.2.3.3 叶绿素荧光测定 采用 Handy Fluor Cam荧光成像仪(Photon Systems Instruments公司生产)测定叶绿素荧光参数，选取主茎上完全展开的桃金娘叶子进行测定，每个处理组重复测定3次。在测定前先对叶片进行20 min暗反应处理，测定指标为最小荧光变量(minimal fluorescence，Fo)、最大荧光变量(maximum fluorescence，Fm)、可变荧光(variable fluorescence，Fv)、最大光能转换效率(maximal photochemical efficiency，Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性(potential photochemical efficiency，Fv/Fo)［13］。

1.2.3.4 酶活性含量测定 盆栽土壤酶活性测定方法［14-17］采用新鲜土样测定，土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸法，土壤脲酶活性采用次氯酸钠比色法，蛋白酶活性采用茚三酮比色法，纤维素酶的活性测定采用蒽酮比色法，过氧化物酶活性采用没食子酸比色法，多酚氧化酶活性采用没食子酸比色法，酸性磷酸酶活性测定采用苯酚钠比色法。

1.3 数据处理

用Microsoft Excel 2003进行原始数据处理，利用SPSS Statistics 18.0进行单因素方差分析(Oneway ANOVA)和LSD多重比较分析以及Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 浸提液对桃金娘生长的影响

银杏叶和根浸提液对桃金娘生长的影响见表1。由表1可知，由于桃金娘苗木购自苗木公司，植株生长情况不能保持完全一致，对苗木的生长量测定试验产生了一定影响。3月初种桃金娘时，试验4、5、10的试验苗的苗高有一定差距，11组试验苗的地径差异性显著。6月测定桃金娘苗木生长3个月后的状况，11组试验苗的苗高差异性不显著，地径差异性显著。由试验苗增长量可知，桃金娘苗木的苗高增长量差异性显著，试验4的增长量最大，试验9、10的增长量最小;地径增长量差异性显著，试验2的增长量最大，试验9、10的增长量最小，低浓度的银杏根浸提液(试验9、10)对苗木的苗高、地径的增长作用不明显，11组试验苗未出现生长停滞和枯死现象，说明了银杏叶和根浸提液对桃金娘苗木的生长抑制作用不显著。由于试验时间(3个月)过短和试验苗木本身存在显著性差异，对本试验的测量结果影响很大，不能明确判断出浸提液对桃金娘苗高、地径的生长影响是否显著;不同浓度同一器官的浸提液处理对桃金娘生长的影响显著性判断依据不足，因此，对本试验中银杏浸提液对桃金娘生长的影响进行下一步探究。

2.2 银杏叶和根浸提液对桃金娘叶绿素荧光参数的影响

图1显示了银杏叶和银杏根不同浓度浸提液对桃金娘叶最小荧光变量Fo、最大荧光变量Fm、可变荧光Fv、最大光能转换效率Fv/Fm、PSⅡ潜在活性Fv/Fo这 5 个指标的影响。处理 1、2、6、7、8 的最小荧光变量Fo均＜处理11，其中:处理1比处理11减少 4.72%、处理 8 比处理 11 减少 4.04%;处理 3、4、5、9、10的最小荧光变量Fo均高于处理11，其中:处理5比处理11增加20.27%、处理10比处理11增加13.12%。银杏叶和根不同浓度浸提液对Fo影响较大，处理5和处理4、10差异性不显著，和其余8组处理结果差异达显著水平。最大荧光变量Fm的变化和最小荧光变量 Fo相似，处理 1、2、3、6、7、8 的最大荧光变量Fm均＜处理11，其中:处理2比处理11减少4.81%、处理 8 比处理 11 减少6.17%;处理 4、5、9、10的最大荧光变量Fm均高于处理11，其中:处理 4 比处理 11 增加 3.47%、处理10比处理11增加3.79%，表明不同浓度浸提液对Fm影响较小。处理 1、2、3、5、6、7、8 的可变荧光(Fv)均低于处理11，其中:处理2比处理11减少4.80%、处理 7 比处理 11 减少6.31%;处理 4、9、10的可变荧光(Fv)均高于处理11，其中:处理4比处理11增加3.47%、处理10比处理11增加3.79%。以上最小荧光变量Fo、最大荧光变量Fm和可变荧光Fv3个指标均呈现出“低促高抑”的现象，最大光能转换效率和PSⅡ潜在活性，在非胁迫条件下，该参数的变化极小，不受生长条件的影响，只有在胁迫条件下该参数明显下降。银杏叶和根在相同浓度的提取液浇灌影响下，桃金娘叶绿素荧光结果呈现出不同的变化趋势，从各试验的最大影响结果来看:最小荧光变量(Fo)试验中，处理5(20.27%)＞处理10(13.12%);最大荧光变量(Fm)试验中，处理 2(4.81%)＜处理 8(6.17%);可变荧光(Fv)试验中，处理 2(4.80%)＜处理 7(6.31%);最大光能转换效率(Fv/Fm)试验中，处理 5(3.09%)＞处理 10(1.18%);PSⅡ潜在活性 Fv/Fo试验中，处理 5(21.59%)＞处理 10(8.99%)，银杏叶浸提液在最小荧光变量Fo、最大光能转换效率Fv/Fm、PSⅡ潜在活性Fv/Fo3组试验中影响比银杏根浸提液显著，银杏根浸提液在最大荧光变量Fm、可变荧光Fv2组试验中影响比银杏叶浸提液显著，即银杏叶和根浸提液对桃金娘叶绿素荧光均有不同程度的影响。由表2可知，最大荧光变量Fm和可变荧光Fv试验差异性不显著，最小荧光变量Fo、最大光能转换效率Fv/Fm、PSⅡ潜在活性Fv/Fo试验差异性显著。

表 1 桃金娘生长状况［1，2］Table 1 Growth status of Rhodomyrtus tomentosa

图1 叶绿素荧光图谱Fig.1 Chlorophyll fluorescence spectrum

2.3 银杏叶和根浸提液对酶活性的作用

图2和表3显示了银杏不同浓度浸提液对桃金娘土壤纤维素酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶这7个酶活性指标的影响。

纤维素酶活性试验，处理 3即 0.025 g·mL－1银杏叶提取液浇灌的桃金娘土壤中纤维素酶活性值最大，处理2即0.05 g·mL－1银杏叶提取液浇灌的土壤中纤维素酶活性值最小，其中:处理2和处理11(CK)差异不显著(P＞0.05)，处理3比处理11增加59.34%，除处理 2比处理 11减少 1.56%，其余 8组处理纤维素酶活性均比处理11增加，同时和处理11差异显著(P＜0.05)，除处理3外，同一浓度处理的银杏叶和根浸提液(处理1和处理6、处理2和处理7、处理4和处理9、处理5和处理10)对纤维素酶活性影响差异不显著(P＞0.05)。

蔗糖酶活性试验，处理 6即0.1 g·mL－1银杏根提取液浇灌的桃金娘土壤中蔗糖酶活性值最大，处理10即0.006 25 g·mL－1银杏根提取液浇灌的土壤中蔗糖酶活性值最小，其中:处理10比处理11减少36.64%，处理1～9比处理 11增加 52.31%～279%，处理6、7、8和处理11的蔗糖酶活性结果差异性显著，即银杏根提取液处理酶活性差异性极显著(P＜0.01)，说明银杏叶浸提液对蔗糖酶活性影响较大。

表2 叶绿素荧光显著性分析［3］Table 2 Significance analysis of chlorophyll fluorescence

图2 酶活图谱Fig.2 Enzyme activity

脲酶活性试验，处理 10 即 0.006 25 g·mL－1银杏根提取液浇灌的桃金娘土壤中脲酶活性值最大，处理9即0.012 5 g·mL－1银杏根提取液浇灌的土壤中脲酶活性值最小，总体呈现“U”字形曲线，其中:处理10比处理11增加了12.09%，其余9组处理脲酶活性均比处理11减少，处理9比处理11减少了80.47%，银杏叶和根浸提液对脲酶活性均有一定影响，脲酶活性差异性极显著(P＜0.01)，同一浓度浸提液处理银杏根浸提液对脲酶活性影响更大。

酸性磷酸酶活性试验，处理3即0.025 g·mL－1银杏叶提取液浇灌的桃金娘土壤中酸性磷酸酶活性值最大，处理 7 和 9 即 0.05 g·mL－1和0.0125 g·mL－1银杏根提取液浇灌的土壤中酸性磷酸酶活性值最小，总体呈现出“W”形趋势，其中:处理1比处理11增加了0.85%，处理3比处理11增加了2.74%，其余处理均比处理11减少，同一浓度处理，银杏根浸提液对酸性磷酸酶活性抑制作用较大。

多酚氧化酶活性变化，总体呈现“低促高抑”趋势，处理8即0.025 g·mL－1银杏根提取液浇灌的桃金娘土壤中多酚氧化酶活性值最大，处理1即0.1 g·mL－1银杏叶提取液浇灌的土壤中多酚氧化酶活性值最小，其中:高浓度提取液抑制多酚氧化酶活性，处理1～4 和处理 6、7、9 比处理 11 减少了0.47%～60.76%，低浓度提取液促进多酚氧化酶活性，处理5、8、10比处理11增加了0.46%～10.28%，多酚氧化物酶活性差异性极显著(P＜0.01)。

过氧化物酶活性试验，处理11即对照组(CK)浇灌的桃金娘土壤中过氧化物酶活性值最大，处理3即0.025 g·mL－1银杏叶提取液浇灌的土壤中过氧化物酶活性值最小，其中:10组处理均比处理11减少，处理 6、7、8 比处理 11 减少 56.71%～66.16%，处理3比处理11减少79.36%，高浓度银杏根提取液浇灌下过氧化物酶活性处理值同处理11呈现显著性差异(P＜0.05)，即在同一浓度处理，银杏根浸提液对过氧化物酶活性抑制作用较大。

表3 酶活显著性分析Table 3 Significance analysis of enzyme activity

蛋白酶活性试验，处理1即 0.1 g·mL－1银杏叶提取液浇灌的桃金娘土壤中蛋白酶活性值最大，处理9即0.012 5 g·mL－1银杏根提取液浇灌的土壤中蛋白酶活性值最小，其中银杏叶浸提液对蛋白酶活性影响较大，处理1比处理11增加138.32%，处理2比处理11增加 118.47%，处理 6比处理 11增加111.64%，处理 9 比处理 11 减少 36.15%，差异性极显著(P＜0.01)。

在低浓度浸提液处理下，即试验 4、5、9、10，纤维素酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶对照之间差异不显著，中、高浓度浸提液处理下试验1～3、6～8对这7种酶的活性均有不同程度的影响，高浓度的银杏叶浸提液，试验1将纤维素酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶活性增强了 9.44%、52.71%、－45.13%、0.87% 、－37.80%、－17.28%、138.32%;高浓度的银杏根浸提液，试验6将纤维素酶、蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶活性增强了11.70%、279.04%、－50.98%、－ 1.84%、－ 2.85%、－ 60.80%、111.64%，银杏根浸提液对酶活性响应较大。

3 结论与讨论

银杏叶和根浸提液对叶绿素荧光响应不显著，叶浸提液对酶活性响应不显著，根浸提液对酶活性响应较大。不同浓度浸提液浇灌下，桃金娘呈生长态势，因此，银杏和桃金娘二者为互利效应，银杏农林复合模式中可以搭配桃金娘，将对银杏林林下复合模式生态环境修复和发展林下经济具有重要的借鉴和参考。

银杏叶和根浸提液对桃金娘植株生长均起到了促进作用，同一浓度不同器官的浸提液处理，根浸提液对桃金娘苗高、地径的生长影响不显著;不同浓度同一器官的浸提液处理对桃金娘生长的影响不显著。陈虹霞［12］等研究低浓度银杏叶聚戊烯醇提取物能够促进小麦种子萌发和幼苗生长，高浓度提取物对小麦种子萌发及幼苗生长呈现抑制作用;刘冬杰［18］等研究随着刺槐枯落叶浸提液浓度的增大，对种子发芽、幼苗生长的抑制作用强度增大;范淑英［19］等研究低浓度浸提液对幼苗生长起促进作用。本研究结果不一致的原因可能是试验时间过短，桃金娘植株生长量小，促进抑制作用不显著。因此，需要进行更长一段时间的研究。

作物产量和植物生物量形成的生理基础是光合作用，其中叶绿素荧光参数常用来判断植物光合作用受到逆境胁迫的伤害，如今植物体内的叶绿素荧光动力学研究已成为热点，在植物逆境生理研究中得到广泛的应用［20］。叶绿素荧光信号包含了丰富的光合作用过程变化的信息，在林木栽培、林木逆境生理等方面的应用较广［21-22］。本试验最小荧光变量Fo、最大荧光变量Fm、可变荧光Fv这3个指标呈现出“低促高抑”趋势，最大光能转换效率Fv/Fm是0.83～0.86，试验组和 CK 试验相比是降低的趋势，与陈辰［23］等植物叶绿素荧光 Fv/Fm一般在0.75～0.85，植物在胁迫生长条件下，叶绿素荧光Fv/Fm降低，PSⅡ反应中心的光能转化过程不成为其限制因子的结果相同;与李曼［24］等在 3.0 mg·L－1BPA 可降低大豆和玉米初始荧光Fo，PSⅡ中心受损，光能转化和电子传递效率降低的结果，以及王春晴［25］等研究木麻黄浸提液处理下青皮苗的叶绿素荧光参数中Fo、Fv/Fm、Fv/Fo等存在显著差异的结果相同。植物在胁迫生长条件下，即高浓度浸提液试验，桃金娘叶绿素荧光参数降低，说明银杏浸提液对桃金娘植株生长有一定影响。

土壤酶活性与植物生长、植物抗逆性生理密切相关，是土壤生物性能的一种最稳定和最敏感的指标，是测定土壤污染所导致的各种变化的一种生物学方法［26-27］。本试验结果中纤维素酶活性略有增强，蔗糖酶和蛋白酶活性同周玉祥［28］等研究酶活性的趋势变化结果相同，蔗糖酶能为土壤生物体提供充分能源，增加易溶性营养物质，反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越强;蛋白酶活性通常被认为是依赖于土壤微生物生物量水平，土壤蛋白酶活性提高，与本研究中加入的银杏浸提液提高了土壤细菌、真菌和放线菌数量有关，具体需进行微生物试验研究。脲酶和酸性磷酸酶与土壤氮、磷循环相关，脲酶活性在浸提液的影响下显著减少，高浓度浸提液对活性破坏较大，同贾丽琴［29］等的研究结果脲酶活性显著提高不同，低浓度浸提液能够提高脲酶活性，高浓度则是抑制作用，有待于进一步试验证明;酸性磷酸酶活性呈现“W”形曲线，低浓度浸提液处理和CK处理差异性不显著;多酚氧化酶活性呈现“低促高抑”趋势;过氧化物酶活性呈现减少趋势，根浸提液试验对酶活性的影响较大，同倪学文［30］等研究银杏外种皮酚酸含量更高的结果相近，银杏种皮含有的化感物质是否更高，有待下一步的研究证明。