全子宫切除术对BALB/c小鼠TDAR实验的影响①

常鹏环 黄守国 林 铃 于欣荣 林莉香 杨照新

(海口市人民医院妇产科，海口570208)

近代研究表明全子宫切除术可造成卵巢功能衰退，引起雌激素水平下调[1-3]。而雌激素除了对生殖系统的影响外，越来越多的研究显示其对免疫系统有着重要的调节作用[4]。本研究通过制备BALB/c种小鼠全子宫切除术模型动物，考察该术式对小鼠T细胞依赖性抗体反应(TDAR)实验的影响，并对术后外周血B淋巴细胞亚群及卵巢形态学等指标进行研究和分析，以探讨该术式对小鼠免疫功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 实验动物：SPF级BALB/c雌性小鼠24只，体重18～22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证：SCXK(湘)2016-0002；所有动物饲养及无菌手术均在海南省药物安全性评价研究中心屏障设施内进行，实验动物使用许可证：SYXK(琼)2016-0013；所用实验动物均经海南省药物安评中心动物伦理委员会批准。主要试剂：钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)购自Sigma公司；不同荧光标记的流式抗体CD3-Percp、CD19-FITC均购自美国BD公司；雌二醇ELISA检测试剂盒(Estradiol parameter assay KIT)购自美国RD公司；酶标二抗(Goat anti-mouse IgG/HRP)购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1实验分组及全子宫切除实验动物模型的建立 将BALB/c雌性小鼠随机分为平行对照组，非手术组和手术组，每组8只；术前12 h禁食禁饮，术后常规饲养，自由饮食；非手术组不予任何处理；平行对照和手术组经腹行全子宫切除术，麻醉成功后，无菌条件下在下腹正中切口，暴露子宫，分离左右侧双角子宫及子宫颈，然后在子宫颈口与阴道连接部位进行结扎，摘除子宫，缝合皮肤并消毒。

1.2.2KLH免疫方法 术后第15天，非手术组和手术组经腹腔注射钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)，首次免疫后第7天加强免疫1次，平行对照组不予注射KLH；于术后第30天，摘眼球采EDTA-2K抗凝血和血清。

1.2.3小鼠TDAR试验检测方法 实验以KLH为特异性抗原进行小鼠TDAR试验检测，具体操作为：应用KLH作为抗原免疫BALB/c小鼠，连续免疫2次，免疫剂量均为2.5 g/kg；采用间接ELISA法检测血中KLH特异性IgG抗体含量，其中Goat Anti-Mouse IgG/HRP抗体稀释倍率1∶4 000，待检血清稀释倍率为1∶800，抗原包被浓度为10 μg/ml；每个待检样品均设复孔；实验结果以OD值表示。

1.2.4其他指标检测方法 采用ELISA法检测外周血清雌二醇含量；采用流式细胞技术检测外周血B淋巴细胞百分比；分离左右侧卵巢，4%中性甲醛固定，常规HE染色。

2 结果

2.1KLH能够刺激BALB/c雌性小鼠外周B淋巴细胞分化增殖 流式细胞仪检测结果发现KLH能够明显刺激手术组(图1C)和非手术组小鼠(图1B)B淋巴细胞分化增殖，与未给予KLH的平行对照组(28.96%±3.77%)(图1A)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1D)；虽然手术组(37.11%±2.68%)和非手术组(34.10%±5.25%)之间比较无明显差异(P>0.05)，但手术组B淋巴细胞百分比较非手术组稍高，机体可能存在代偿反应。

2.2全子宫切除术能够下调BALB/c雌性小鼠血清KLH IgG抗体生成 血清KLH IgG抗体检测结果表明，全子宫切除术能够降低手术组血清KLH IgG抗体生成量，手术组(0.817 0±0.315 0)和非手术组相比(1.135 8±0.298 4)(图2)，差异具有统计学意义(P<0.05)；手术组(0.817 0±0.315 0)和非手术组(1.135 8±0.298 4)与平行对照组(0.431 8±0.102 3)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3全子宫切除术能够降低BALB/c雌性小鼠卵巢雌二醇的分泌 通过ELISA法检测外周血雌二醇含量，发现全子宫切除术能够下调手术组和平行对照组雌二醇生成，手术组(35.59±8.24)pg/ml和平行对照组(33.38±9.39)pg/ml相比非手术组(51.06±10.97)pg/ml，差异具有统计学意义(P<0.05)；手术组和平行对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4全子宫切除术能够引起卵巢组织形态学改变 肉眼观卵巢体积缩小，镜下多数卵泡形态不规则，可见偏位，颗粒细胞松散、固缩，部分凋亡，见图4。

图1 各组外周血B淋巴细胞百分比Fig.1 Percentage of B lymphocyteNote: *.P<0.05.

图2 各组血清KLH IgG抗体含量Fig.2 Concentration of serum KLH IgGNote: *.P<0.05.

图3 各组血清雌二醇含量Fig.3 Concentration of serum estradiolNote: *.P<0.05.

图4 各组卵巢组织形态学检查结果(HE染色，×200及×400)Fig.4 Result of ovarian histomorphological changes(HE staining,×200 and ×400)Note: B.The no-operated group was normal ovarian tissue；A and C.In the parallel control and operated group,the size of the ovary was reduced,and the number of mature follicles was decreased under the microscope.Most of the follicles were irregular,and the granulosa cells were loose,pyknosis and some apoptosis.

3 讨论

雌二醇虽然为脂溶性的类固醇性激素，却对多个组织器官有影响，近代研究显示其对免疫系统也有着重要的调节作用，在DC细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞等免疫细胞表面发现雌激素受体(ER)，这些证据表明雌激素与免疫系统有着非常重要的联系[4，5]。同时越来越多的证据表明子宫也能分泌细胞因子、酶和生物活性物质，对维持机体的生理、病理过程有着极其重要的作用[6]。另外，子宫切除术后由于邻近血管的结扎，破坏卵巢与子宫之间的解剖学和功能学的完整性，使术后卵巢的血液供应减少，造成卵巢功能的衰退，血清雌激素水平下降[2-4]。这种卵巢功能的衰退和血供减少，在组织形态上主要表现为卵巢内卵泡数量减少及细胞凋亡、间质增生等[7]。本研究中也发现手术组和平行对照组小鼠卵巢多数卵泡形态不规则，可见偏位，颗粒细胞松散、固缩、部分凋亡，与文献报道基本一致。

为了考察全子宫切除术是否对BALB/c种小鼠免疫功能产生影响，本研究以KLH为特异性抗原考察小鼠全子宫切除术对TDAR实验的影响，发现该术式可以下调手术组小鼠外周血KLH IgG抗体含量，与非手术组相比存在明显差异，但高于平行对照组(未给予KLH)，提示全子宫切除术能够抑制T淋巴细胞介导的抗原抗体反应，减少KLH特异性抗体生成。TDAR实验是B淋巴细胞针对T细胞依赖性抗原产生的免疫应答，需要Th2淋巴细胞协助完成。KLH进入机体以后，诱发机体免疫应答，由巨噬细胞和DC细胞等抗原递呈细胞活化Th2细胞，后者辅助B淋巴细胞产生特异性抗体，上述过程包括抗原处理、递呈、B细胞分化增殖、细胞因子分泌等一系列反应步骤，任何步骤出现问题，均可造成抗体生成异常。现代研究表明免疫系统与卵巢功能关系密切、相互作用，例如：雌激素调节Th1/Th2细胞分泌细胞因子的途径，主要通过T淋巴细胞雌激素受体α介导完成[8]；Kumru等[9]证实经腹子宫全切术后患者的淋巴细胞亚群CD4+CD8+细胞的比例降低和细胞因子IL-4、IFN-γ降低，进一步说明了雌激素可能具有重要的免疫功能调节作用。而本研究通过检测外周血清雌二醇含量发现：全子宫切除术可使手术组和平行对照组小鼠外周血雌二醇含量明显降低，进一步说明全子宫切除术能够通过抑制雌二醇的分泌，下调机体对外来性抗原免疫应答的能力，从而影响机体免疫功能。

非常有意思的是本研究发现手术组和非手术组小鼠外周血B淋巴细胞虽然无明显统计学差异(P>0.05)，但是手术组B淋巴细胞所占百分比要比非手术组高一些，这种现象可能与机体代偿调节有关，KLH进入机体后可刺激B淋巴细胞分化增殖，但由于手术组雌激素分泌水平较低，抗体生成减少，导致机体代偿刺激B淋巴细胞分化增殖更多一些，具体机制后期将进一步研究。

综上所述，全子宫切除术能够通过降低BALB/c种小鼠雌激素分泌水平，降低机体对外来抗原产生免疫应答的敏感性，进而影响机体的免疫功能。关于雌激素是如何诱导DC细胞，影响B淋巴细胞减少抗体分泌的分子机制将在后期进行深入研究。