利用分子标记辅助选择改良两系不育系SE21S的香味

刘玉芹

（福建省农业科学院水稻研究所，福建福州350018）

长期以来水稻育种家侧重高产育种以解决人民温饱问题，而忽视了优质育种。随着社会的发展以及人民生活水平的日益提高，消费者对于稻米品质的要求越来越高，带有香味的优质大米愈来愈受消费者的青睐，尤其是米粒细长的香米型稻米。因此，培育高产质优的高档香米愈来愈受到水稻育种者的重视，而不育系是影响杂交稻稻米品质的关键因素之一［2-3］。

SE21S是福建省农业科学院水稻研究所选育的光温互补籼型两系核不育系，具有不育起点低（23.5℃），不育期长、稳定、配组自由度高、制种安全、熟期转色好、直链淀粉含量低（14.9%）、 谷粒细长等优点［4］。SE21S是从“九五”至今福建及南方稻区两系杂交稻配组频率较高的不育系［5-6］。以其为母本，配制的杂交稻品种通过审定的有14个，分别为两优2186、福两优366、两优2161、两优2111、两优688、两优航2号、两优2167、两优多系1号、两优1019、两优2163、两优1259、两优科丰6号、两优15、两优1586。其中两优2186推广面积最大，自审定以来累计推广面积超过33.33万hm2（数据来源国家水稻数据中心，中国水稻品种及其系谱数据库，http：//www.ricedata.cn/variety/index.htm），另外，福两优366、两优2161、两优688、两优1259和两优2111目前还在福建、云南等省大面积推广。

改良SE21S的稻米香味品质，不仅为打造集高产、米质优、抗性强、低直链淀粉含量等4大优势于一体的理想型SE21S拓宽不育系遗传背景，还对提高SE21S配组组合的商品经济效益，增加农民的收入具有十分深远的意义。香味的传统鉴定方法有咀嚼法、KOH浸泡法等，受主观因素，作物生长环境影响大，费时费力，严重制约育种进程，而利用香味基因特异性的分子标记进行选择，可有效缩短育种进程，它只需取少量的DNA即可，不受生育期和生育季节以及其他外部环境条件的影响，分析快速便捷［1］。

研究以香型软米福香25B为香味供体亲本，SE21S为受体亲本，采用回交育种和分子标记辅助选育方法与田间农艺性状调查相结合，将香味基因导入SE21S中。香味基因分子标记用GRFM04，它是依据水稻隐性香型品种与非香型品种的香味基因序列之间存在8bp碱基缺失，设计的Indel功能标记,该标记可区分香型纯合，非香型纯合和杂合3种基因型,且检测的带型与田间对应的香味性状完全对应［1］。在回交各代利用GRFM04进行香味基因的前景选择，并结合农艺性状选育合适的株系留种，另外在高代BC6F1代利用检测水稻品种真实性标准的48个SSR标记加选遗传背景，以减少后期田间自交分离的工作量。最后筛选到了5份遗传背景与轮回亲本基本相同但具有香味基因的SE21S改良株系。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以IR58025B的改良系福香25B为供体亲本，以福建省农业科学院水稻研究所育成的两系光温敏核不育系SE21S为轮回受体亲本，回交6代。用Indel标记GRFM04［1］对各回交F1代进行分子检测跟踪香味基因,背景回复分析用检测水稻品种的真实性标准的48个SSR标记。

1.2 水稻基因组DNA提取

在回交各代中取叶片，编号提取水稻基因组DNA。DNA提取用适于PCR的高通量DNA提取方法［7］。

1.3 PCR扩增

引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SSR扩增反应采用10μLPCR反应体系（表1）在ABI公司Veriti PCR仪上进行，反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸45 sec，循环35次，72℃补充延伸7 min，最后4℃保存。

表1 10μl PCR反应体系

1.4 电泳及成像

PCR扩增完之后，往产物中加2ul 6xloading buffer,以1xTAE作电泳缓冲液，通过8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，电压100 v,1.5 h。电泳完取下凝胶，用致善生物公司的Genefinder核酸染料对其染色20 min，最后用Gel Explorer凝胶成像仪成像保存。

1.5 香味鉴定

叶片香味鉴定参照KOH浸泡法［8］。将大约2 g新鲜叶片剪碎，放入培养皿中，加入10 mL 1.7%KOH溶液，盖好盖子，室温浸泡15 min，然后打开盖子，3人轮流闻其是否有香味。

米粒香味鉴定参照咀嚼法［9］。从每株供试植株随机选取一穗中的20粒种子晒干后进行咀嚼检测香味。如果20粒全不香则认为该植株无香味，为非香类；如果20粒全香则归为有香类；如果20粒种子有香与不香则归为杂合分离类。

2 结果与分析

2.1 利用分子标记辅助筛选含香味基因型的SE21S的回交群体

在双亲杂交回交的各代过程中，利用水稻香味基因特异性标记GRFM04对轮回亲本SE21S、香味基因供体亲本福香25B以及各回交群体F1代基因组DNA进行PCR扩增，筛选含有香味基因型的回交个体。在所分析的图谱中有3种带型，轮回亲本SE21S不含香味基因带型记为1；供体亲本福香25B含有香味基因带型记为2；含双亲杂合带型的香味基因型记为3，不含香味基因型的回交株系其带型表现为和轮回亲本一样的带型，记为1。例如，在BC6F1群体GS89和GS92两个群体中，分别有10株有香 味杂合基因型（见图1a，1b中标*的株系）。

图1 GS89、GS92群体香味基因的分子检测

2.2 香味传统鉴定法验证分子检测筛选的植株

用KOH浸泡叶片法和咀嚼法香味鉴定分子检测筛选的植株，发现杂合基因型的植株叶片无香味，只有部分米粒香，而自交1代后纯合基因型的叶片才表现出香味。咀嚼法鉴定回交F1代的杂合基因型植株与香味标记GRFM04分子检测的结果一致。结果表明KOH浸泡叶片法不能鉴定出杂合基因型的植株，只能鉴定出纯合香味基因型的植株，如果用此法各回交F1代再自交1代才能选到目的植株，这样不仅延长了育种时间，还对鼻孔通道有损害，受人为主观因素影响大，选择准确率低，易造成香味基因的丢失；而咀嚼法虽然可以鉴定出各回交F1代的杂合基因型植株，但是也要等结实收种后才能鉴定，而且易味觉疲劳，严重制约育种进程。综合考量还是用基于香味基因序列开发的功能标记进行分子检测筛选目的植株更为便捷，它与香味基因共分离，不会因重组而打破，可以在各回交F1代幼牙或苗期准确地筛选到杂合香味基因型的植株，大大缩短选育进程。

2.3 背景回复分析含香味基因型的株系

在混合池背景回复分析中用农业部2014年修订的用于水稻品种真实性的DNA指纹图谱分析中的48个SSR标记对2个群体混合池进行检测，并对其背景回复进行分析。将上述GS89与GS92含有香味基因型的单株（标*的）基因组DNA构建混合池，分别命名GS89混，GS92混。然后用鉴定水稻真实性标准的48对引物扩增SE21S、福香25B、GS89混、GS92混。结果显示GS89混和GS92混有46个位点与轮回亲本SE21S相同（部分位点见图2a），在2个位点RM71和RM85处这2个混合池含双亲的杂合带型，说明背景有未回复的单株。其中，GS89混和GS92混在RM71位点均为双亲杂合带，说明该位点2个群体均有未回复的单株；GS92混在RM85位点为双亲杂合带，说明组成该混合池的单株有未回复的（图2b）。

图2 GS89混和GS92混的背景回复分析

用RM71检测构建GS89混单株DNA，用RM71、RM85检测构建GS92混的单株DNA，进而确定这两区的单株回复情况。结果显示，GS89群体中携带香味基因的10个单株中有单株2-5、2-7、2-8、4-3共4株遗传背景完全回复（图3a）；GS92群体中3-6共1株遗传背景完全回复（图3b）。

图3 背景未回复的标记检测GS89混和GS92混的各单株

结果筛选到 GS89 2-5、GS89 2-7、GS89 2-8、GS89 4-3、GS92 3-6这些单株中不仅含有供体亲本福香25B的香味基因，而且这些株系背景回复均达到了100%，理论上这些株系与轮回亲本SE21S的遗传背景完全一样且含有香味基因，可以通过自交分离获得纯合的香味SE21S,直接用于配制组合，在生产上大面积使用,进一步提高SE21S配制组合的稻米品质。

3 讨论

随着分子生物学技术的发展，香味育种越来越多的应用分子标记辅助技术。朱映东等利用酶切分子标记辅助选育，将香型正常胚水稻里的香味基因导入到非香巨胚水稻中成功地选育出香型巨胚水稻“上师大8号”［10］；杜雪树等利用香味Aro标记辅助选育，将香稻品种美香占的香味基因导入到恢复系986和R476中，最终选育出抗白叶枯病基因Xa21和抗褐飞虱Bph14的香型恢复系C349和C354［11］。赵志鹏等通过香味分子标记辅助选育，将粳稻“武香075”的香味基因导入优质水稻“金丰”中，成功选育出优质高产香型粳稻“香粳1305”［12］。本研究意在将IR58025B的改良系福香25B的香味基因通过回交选育结合分子标记和田间农艺性状辅助选育导入SE21S中，并在BC6F1代中增加背景回复筛选。由于在各回交1代幼芽阶段就可用分子标记筛选目的植株，进行下一轮的回交，省去了大量田间管理工作，所以利用分子标记辅助选育既快速地跟踪选择了香味基因，又保证了在杂交过程中背景的纯度，加快了育种进程。