KIBRA基因多态性对健康年轻志愿者海马亚区体积影响的研究

梁雪，王芳芳，王坤，张庆雷，吴思楚，青钊，张鑫，李茗，张冰

作者单位：

南京大学医学院附属鼓楼医院，医学影像科，南京 210008

基因学研究表明肾脑表达蛋白(kidney and brain expressed protein，KIBRA) rs17070145位点基因与人类记忆功能密切相关[1]。虽然先前研究认为KIBRA作为一种突触后支架蛋白，涉及囊泡运输、转录的调节和突触发生等过程[2]，但其确切潜在神经机制还并不清楚。研究表明KIBRA的多态性对记忆功能影响与海马的结构和功能变化有密切的联系[1，3-4]。功能磁共振研究显示CC纯合子携带者与T基因携带者间海马功能激活程度存在差异[1，3]，结构磁共振研究结果显示T基因携带者较非T基因携带者海马体积增大[5-6]，并且在健康老年人中的研究显示CA2和CA4/齿状回海马亚区的体积也有差异[6]。这些研究中，大部分研究对象都是西方人群，对中国汉族人群的研究还较少。目前发现一篇功能磁共振关于KIBRA基因多态性和脑默认网络及执行网络影响的研究[7]，还有一篇磁共振扩散峰度成像的研究[8]。但还未见关于磁共振海马亚区研究的报道。因此，本研究采用磁共振海马亚区体积自动分割方法，研究KIBRA基因多态性对健康年轻人海马亚区体积的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究志愿者入组标准：(1) 20～30岁；(2)中国国籍；(3)汉族；(4)右利手；(5)无神经及精神系统疾病；(6)无脑创伤、药物及酒精依赖史或其他可能影响脑结构与功能的疾病；(7)无MR检查禁忌证。本研究经过南京鼓楼医院伦理委员会批准，所有志愿者均自愿参加实验，在实验前签署知情同意书。

根据上述入组标准，共招募志愿者63名，其中由于3名缺少血液样本及基因型数据被排除；最终60名志愿者纳入本研究。

1.2 基因分型

所有被试均留取外周静脉血约2 ml，ED-TA抗凝，-80℃冰箱存储。利用EZgeneTM血液gDNA小量提取试剂盒，从1 ml全血中提取受试者的基因组DNA，应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)-连接酶检测反应(ligation detection reaction，LDR)的方法[9-10]，检测受试者KIBRA基因rs17070145位点C/T等位基因多态性；一共分为3种基因型：C/C、C/T和T/T。根据不同基因型将受试者分成两组，一组为C等位基因携带者(包括C/C和C/T)，另一组为TT纯合子携带者。

本研究中60名志愿者中，有2名C/C纯合子，21名C/T杂合子和37名T/T纯合子，其中CC纯合子分布频率为3.3%，TT纯合子分布频率为61%，与先前研究相似[7-8]，并且基因分布频率也符合Hardy-Weinberg分布(χ2=0.22，P=0.64)。KIBRA基因多态性由于rs17070145位点由T突变为C所致，基因型分组实际情况是按照KIBRA等位基因在人群中的比例来划分的。由于国内CC纯合子携带者在人群中的比例较小，TT纯合子携带者比例较大，而西方人群CC纯合子携带者在人群中的比例约为50%，TT纯合子携带者比例较小。因此，为避免一组样本过少导致统计模型失效，通常西方人研究中按CC纯合子和T携带者分组进行对比，而在中国人群中则相反将C等位基因携带者和TT纯合子进行对比。以往研究结果显示无论是按照“CC纯合子携带者和T等位基因携带者”还是按照“C等位基因携带者(包括C/C和C/T)和TT纯合子携带者”来分组，含CC纯合子携带者组记忆力表现更差，并且相应的脑结构和功能区表现相类似[3-7，11-12]。因此，考虑样本数限制，本研究延续以往中国人群研究中的方法，对KIBRA基因按C等位基因携带者(包括C/C和C/T)和TT纯合子携带者来分组的方案。

1.3 神经心理学相关测试

本研究采用了记忆功能评估相关的神经心理学量表。包括简易精神状态量表(mini-mental state examination，MMSE)、蒙特利尔认知评估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)、数字连线试验-A (number connection test type A，NCT-A)和数字连线测验-B (number connection test type B,NCT-B)、以及韦氏记忆量表中的逻辑记忆测验和数字广度(顺背和倒背)。随机抽取23名被试，在磁共振检查前3 d内进行了所有的神经心理学测试。

1.4 磁共振数据采集

使用荷兰Philips公司生产的Achieva 3.0 T TX双梯度双射频源磁共振成像系统，SENSE-8-HEAD线圈(Achieva 3.0 T TX dual-source parallel RF excitation and transmission technology，Philips Medical Systems，The Netherlands)。所有受试者均先行常规MRI检查以除外其他引起脑结构改变的疾病。采用三维超快速场回波(3D-TFE) T1WI序列矢状位扫描，扫描参数：重复时间(repetition time，TR) 7.7 ms，回波时间(echo time，TE)3.4 ms，视野(field of view，FOV) 256 mm×256 mm×178 mm，voxle size 1×1×1，层间距为0，反转角90°。海绵固定受试者头部，用橡胶耳塞塞耳，尽可能保持头部不动。

1.5 数据处理

海马体积分析采用美国哈佛大学FreeSurfer v5.3.0 (http://surfer.nmr.mgh.harvard/ freesurfer/)软件完成。Freesurfer将原始的dicom图像数据转换成.mgz格式后，通过计算每个体素与神经解剖结构特点相匹配的概率，按概率配准到已经集成的人工模板，对皮质和皮层下结果进行全自动分割。主要步骤包括运动矫正，混合区域变形或表面变形去除非脑组织，Talairach变换，分割皮层下白质和深部灰质结构，最后获得海马亚区的脑结构体积[13]。

FreeSurfer5.3.0软件将海马分为CA1、CA2_3、CA4_DG、下托(subiculum)、前下托(presubiculum)、海马裂(fissure)、海马伞(fimbria)以及无法分割的尾区(标记为 hippocampus) 8个亚区(图1)。在其完成之后，人工检查FreeSurfer对海马体积的分割结果，笔者将分割严重超出海马区域的脑区进行手动分割，然后再次计算海马体积。同时，利用FreeSurfer估算的颅内容积(estimated total intracranial volume，eTIV)作为协变量来校正海马体积，以去除每个人头部大小不一所导致的海马体积差异。

由于海马伞和海马裂为脑白质部分，海马尾部为不能再分割为任何亚区的结构，因此，本研究只关注CA1、CA2_3、CA4_DG亚区、下托、以及前下托的体积。

图1 海马亚区示意图，不同颜色代表不同海马亚区Fig. 1 Schematic hippocampal subfields, different colors represent different hippocampal subfields.

表1 所有受试者一般特征资料Tab. 1 Demographic data of subjects

表2 23名受试者神经心理学量表测试结果及一般资料Tab. 2 Demographic data and neuropsychological tests of 23 subjects

表3 C等位基因携带者组与TT纯合子携带者组海马亚区体积统计结果Tab. 3 Volumes of the hippocampal subfields in different groups (mm3,

表3 C等位基因携带者组与TT纯合子携带者组海马亚区体积统计结果Tab. 3 Volumes of the hippocampal subfields in different groups (mm3,

注：以eTIV为协变量的一般线性模型试验

CC+CT (23名) TT (37名) P值CA1左325.65±34.97 308.24±36.82 0.032右355.53±40.49 349.33±34.64 0.323 CA2_3左 1012.87±136.45 1009.73±108.09 0.399右 1085.86±125.87 1078.13±115.05 0.223 CA4_DG左572.96±74.98 575.53±57.72 0.624右612.67±69.46 607.98±57.52 0.260前下托左507.77±50.53 509.45±44.12 0.786右493.91±54.18 507.32±48.57 0.520下托左636.26±73.50 636.55±59.13 0.778右650.12±59.50 660.44±55.19 0.781

1.6 统计学分析

数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析与处理。定量资料用均数±标准差表示，定性资料采用相对比或百分比表示；其中性别属于定性资料，采用χ2检验。将eTIV作为协变量，去除每个被试头部大小不一所导致的海马体积差异，采用线性回归检验对两组受试者进行组间比较。然后，再将有统计学差异的海马亚区体积与神经心理学量表进行Pearson相关性检验。

表4 Pearson相关检验结果Tab. 4 Relationship between neuropsychological tests and left CA1 hippocampal subfields volume

图2 在23名受试者中，左侧海马CA1区体积与NCT-B完成时间呈正相关Fig. 2 Of the 23 subjects, volume of the left hippocampal CA1 region was positively correlated with NCT-B completion time.

2 结果

2.1 受试者一般特征资料

C等位基因携带者组与TT纯合子携带者组年龄、性别及受教育程度差异均无统计学意义(P＞0.05，表1)。并且两组间颅内总体积eTIV也无统计学差异(P=0.192)。另外，其中23名志愿者行神经心理学量表测试，结果见表2。结果显示NCT-A和NCT-B时间两组被试间均存在统计学差异(P＜0.001、P=0.006)。

2.2 关于C等位基因携带者组与TT纯合子携带者组海马亚区体积统计结果

由于颅内总体积有个体差异，并且颅内总体积与海马体积有一定相关性，尽管C等位基因携带者组与TT纯合子携带者组颅内总体积无统计学差异，为了减小每个被试头部大小不一所导致的海马体积差异，本研究采用线性回归检验，将eTIV做为协变量，来探讨两组间海马亚区体积的差异。

研究结果显示与TT纯合子携带者组相比，TT纯合子携带者组左侧海马CA1区体积增大(P=0.032)，而其他各亚区体积组间差异均无统计学意义(表3)。

2.3 有统计学差异的海马亚区体积与神经心理学量表Pearson相关性检验结果

Pearson相关结果显示，在23名受试者中，左侧海马CA1区体积与NCT-B完成时间呈显著正相关(r=0.459，P=0.028)，结果表4和图2。而左侧海马CA1区体积与其他神经心理学量表无显著相关性(P＞0.05)。

3 讨论

本研究结果显示，在健康年轻受试者中，C等位基因携带者组与TT纯合子携带者组相比左侧CA1区海马亚区体积增大，并且C等位基因携带者组神经心理学量表NCT-A和NCT-B完成时间明显大于TT纯合子携带者组。另外左侧CA1区海马亚区体积与神经心理学量表NCT-B完成时间呈正相关。

海马位于大脑半球的内侧面，是组成大脑边缘系统的一部分，与记忆以及空间定位相关，并且参与注意的调节[14]。组织病理学研究和动物模型表明，海马不是一个整体的结构，而是由几个具有不同组织学特征的亚区组成，如下托，cornu ammonis (CA1-3)和齿状回(dentate gyrus，DG)[15]。本研究结果显示，与TT纯合子携带者组相比，C等位基因携带者组只有左侧海马CA1区体积明显增大，而右侧海马及左侧海马其他亚区间均无统计学差异，表明在健康年轻受试者中，左侧CA1区海马亚区体积受到KIBRA基因多态性的影响，而其他海马亚区并未受到影响。本研究结果与先前磁共振研究结果[5-6]并不吻合，主要原因可能有以下几个方面：第一，研究对象种族差异，本研究对象是中国人，而先前研究为西方人群。第二，研究对象年龄差异，本研究对象是年轻人，而先前研究为老年人[6]。先前研究表明T等位基因携带者较C/C纯合子携带者海马亚区体积增大，而本研究结果是C等位基因携带者组较TT纯合子携带者组海马亚区体积增大，有研究表明汉族人群中KIBRA等位基因频率在不同年龄段有差异[16]，笔者猜测KIBRA等位基因不同年龄段对海马的影响机制不同，然而这一结果需要不同年龄段的人群研究来验证。第三，由于本研究样本量的限制，可能抽样误差增大所导致，今后还需要大样本量及多个年龄段人群的研究来完善。

大量研究表明KIBRA基因与情景记忆之间存在相关性[1，3，5-6，11]。一项基于8000人的Meta分析表明KIBRA T等位基因对情景记忆具有保护性作用[12]，TT纯合子携带者组情景记忆得分高于C等位基因携带者组。本研究结果显示，NCT-A和NCT-B完成时间明显大于TT纯合子携带者组，而完成时间越长，表明认知功能越差，这与先前研究结果相吻合[7]。并且，左侧海马CA1区体积与NCT-B完成时间呈正相关。连线测试主要检测空间知觉、注意广度和视觉运动协调功能。海马CA1区的功能主要与空间记忆和中间记忆过程相关。海马CA1区体积与NCT-B完成时间呈正相关，即C等位基因携带者组海马CA1区体积越大，NCT-B完成时间越长，说明空间记忆和执行功能越差，表明KIBRA C等位基因携带者左侧CA1区海马亚区体积的增加可能是对空间记忆和执行功能减低的一种代偿作用。

本研究条件下，在健康年轻受试者中，左侧CA1区海马亚区体积受到KIBRA基因多态性的影响，KIBRAC等位基因携带者左侧CA1区海马亚区体积的增加可能是对空间记忆和执行功能减低的一种代偿作用，该研究结果有助于KIBRA基因多态性与健康年轻人空间记忆和执行功能关系神经机制的研究。