水中粪大肠菌群检测方法的对比

何 敏，张亚娟，周艳红，余沛芝，周 婷，董晓晨，赵赛君，邹真妮，Yun Yunbo，刘洪波

(1.苏州工业园区清源华衍水务有限公司水质检测中心，江苏苏州 215021； 2.上海理工大学环境与建筑学院，上海 200093；3.亚琛工业大学水和固体废物管理研究所, 德国亚琛 52056)

饮用水安全密切关系到社会文明建设和人民群众身体健康，越来越受到政府和人民群众的重视[1]。中国的饮用水和水源水的卫生学评价指标为(耐热)粪大肠菌群[2]，它是评价水质的重要指标，具有广泛的卫生学意义。水体中粪大肠菌群主要来自人畜粪便的污染，其对氯的抵抗力相似于肠道致病菌。该菌的检测方法主要为多管发酵法和酶底物法等[3]。

多管发酵法是根据粪大肠菌群发酵乳糖、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢菌来判定菌群，它是目前检测粪大肠菌群的标准方法。多管发酵法有技术成本低、结果准确等优点，但可检测时间长、试验过程操作繁琐和最后的试验结果还需验证等劣势，使其不能快速检测水体中的粪大肠菌群[4]。李永[5]曾评定多管发酵法检测污水中的粪大肠菌群的结果不确定性，检测过程不同阳性管的使用和试验操作都可能为测定结果带来很大的不确定性。古丽茹合萨热·艾海提[6]提出，使用多管发酵法检测粪大肠菌群时必须要保证培养基的质量，注重培养基的pH和高压灭菌情况，说明该方法试验过程要求高、操作繁琐。

酶底物法是根据大肠菌群细菌能产生特异性的β-半乳糖酶，分解邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷ONPG的原底物，使培养液呈黄色[7]，指示水体中粪大肠菌的存在。唐慧颖[8]采用固定底物酶底物法，对瓶装矿泉水、水厂取水口水、长江水、污水处理厂出水、城区河道水和畜禽养殖场出水中的粪大肠菌群，分别进行平行双样测定，相对偏差为0～12%，且在测定较清洁水样中的粪大肠菌群时，具有较高的精密度。汤琳等[9]研究发现酶底物法在应急监测中检测粪大肠菌群有很好的适用性。它还可在普通实验室操作，快速检测，无需验证，能够弥补多管发酵法的不足，但目前还未列入《水和废水监测分析方法》中，需进一步验证其可行性。本试验是选用多管发酵法和酶底物法作对比，验证酶底物法检验水样的准确性及方便性。

1 材料与方法

1.1 样品来源

试验水样分别采集于苏州某自来水厂过程水、苏州太湖水域水源水、苏州某污水厂污水进、出水。按照无菌条件[10]采集水样500 mL于灭菌的玻璃瓶中，置于4～8 ℃的冰箱中，2 h内送到实验室进行检测。

1.2 仪器设备与试剂

1.2.1 仪器设备

培养箱(上海一恒)、立式压力蒸汽灭菌器(Yamato)、程控定量封口机(Biostron)等仪器。

1.2.2 试剂材料

试剂：乳糖蛋白胨、EC肉汤、伊红美蓝琼脂(北京陆桥)、科立得Colilert-18等试剂。

材料：试管、试管架、90 mm培养皿、接种环、无菌采样瓶、科立得97孔定量盘等用具。

1.3 试验方法

多管发酵法。参考《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750.12—2006)和《水和废水监测分析方法》第四版增补版。将水样分别接种到盛有乳糖胆盐培养基的发酵管中。在37±0.5 ℃下培养24±2 h。产酸和产气的发酵管说明试验呈阳性，轻微震荡后，用3 mm接种环将培养物转接到EC肉汤培养液中，在44.5±0.5 ℃下培养24±2 h。

酶底物法。先在100 mL的水样中加入科立得Colilert-18试剂，摇匀完全溶解后倒入科立得97孔定量盘中，在定量封口机过塑封装。然后置于44.5±0.5 ℃培养箱中培养24 h进行结果判读，如果产生可疑阳性，可延长时间至28 h，超过28 h后出现的颜色不作为阳性结果。

数据统计。数据整理统计方法使用excel和SPSS10.0软件中的t检验。

2 结果与分析

2.1 质控标样

本次试验将认证的商售IDEXX-QC大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)和绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)分别作为阳性和阴性控制菌株，多管发酵法和酶底物法分别对其进行检测分析，检测结果如表1所示。由表1可知，两种方法对阳性大肠埃希氏菌的测定数值均在置信范围内，且均未检测出阴性绿脓假单胞菌，可用于后面的试验分析。

表1 质控标样测定结果比较Tab.1 Comparison of Determination Results of Quality Control Standard Samples

2.2 较清洁水样两种方法结果比对

对60份水样进行检测，其中第1～20份是自来水厂过程水、21～40份是苏州太湖水域水源水、41～60份是苏州某污水厂加次氯酸钠和紫外消毒处理后的出水，分别用多管发酵法和酶底物法进行检测，结果如图1、表2及表3所示。

图1 较清洁水样两种方法结果比对Fig.1 Comparison Results between Two Methods for the Cleaner Water Samples

表2 较清洁水样多管发酵法和酶底物法相关系数Tab.2 Correlation Coefficients of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for the Cleaner Water Samples

结果显示，两种方法的检测数据变化大致相同。相关系数r=0.947，可看出两组数据的相关性很好，P=0.000，说明两组数据的相关性趋于一致[11]。对两种方法的结果进行配对t检验，t=0.231，P=0.818(>0.05)，即差异没有显著意义。可认为酶底物法与多管发酵法没有区别, 效果是相同的。肠杆菌属要延迟发酵[12]，苏州太湖水源水用多管发酵法时注意初发酵要延迟，文献[13]是通过阳性管进行平板分离提取菌株总DNA作为模板，使用16S rRNA进行PCR扩增证实太湖源水肠杆菌属中的阴沟肠杆菌延迟发酵，建议将多管发酵法测定总大肠菌群的乳糖发酵时间延长48 h，保证检测结果会更准确。

表3 较清洁水样多管发酵法和酶底物法配对t检验结果Tab.3 Paired t Test Results of Multiple Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for the Cleaner Water Samples

2.3 污水进水结果两种方法比对

对30份污水进水水样进行检测，为了使结果影响因素少，多管发酵法和酶底物法选用200 000倍的稀释倍数来稀释水样，结果如图2、表4及表5所示。

结果显示，r=0.602，表明两种方法相关性较强，P=0.000，两组数据的相关性趋于一致。对两种方法的结果进行配对t检验，t=0.373，P=0.712(>0.05)，即两种方法测定结果的差异没有显著意义，可认为两种方法是等效的。但文献表明[14]，酶底物法检测水样时，污水稀释度越高，测定结果就越偏低。本试验在检测污水和清洁水样的粪大肠菌对比中得出，污水水样的结果偏低，所以在日常检测粪大肠菌时，应准确掌握污水可稀释的最小倍数，保证检测结果准确。

图2 污水进水水样两种方法结果比对Fig.2 Comparison Results of Two Methods for Wastewater Influent Water Samples

表4 污水进水多管发酵法和酶底物法相关系数Tab.4 Correlation Coefficient of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for Wastewater Influent

表5 污水进水多管发酵法和酶底物法配对t检验结果Tab.5 Paired t Test Results of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method for Wastewater Influent

3 讨论

通过配对t检验比较两种方法检测较清洁的水样和污水厂进水中含不同粪大肠菌的浓度，从结果一致性的角度来看，多管发酵法和酶底物法无统计学意义上的显著性差异。

表6为这两种方法优缺点的比较。多管发酵法是一直沿用的方法，积累了很多年的经验，对污水进水检测还是很灵敏的，且数据可靠，但反应时间长、试验过程繁琐，若是不应急的水样使用多管发酵法则可以获得更准确的数据。

酶底物法用于检测水样中的粪大肠菌群是可靠的，相比于多管发酵法，它具有较多的优势特点。美国、欧洲等国家选用酶底物法检测自来水厂的粪大肠菌群，除此之外，应急水样检测也使用了该方法。

表6 多管发酵法和酶底物法的优缺点比较 Tab.6 Comparison of Advantages and Disadvantages of Multi-Tube Fermentation Method and Enzyme Substrate Method

4 结论

酶底物法特别适用于较清洁的水样，它能够快速、稳定地检测出结果，尤其是应急水样。本试验中酶底物法置信度95%的差异说明检测结果的一致性，但检测污水水样稀释倍数越高，测定结果会有所降低，若污水稀释倍数低，误差不大时可被应用。酶底物法应当不断改进优化，日后可作为评价水质微生物重要的检测方法得以推广。