住院腹泻患儿杯状病毒感染特征分析

姜洪波,孟婷玉,孙利伟*,田玉玲,王承训,赵艳玲,贺 岩,黄艳智,黎伟明,李 响

(1.长春市儿童医院,吉林 长春130051；2.吉林省疾控中心)

杯状病毒为杯状病毒科单股正链RNA病毒，国际病毒分类委员会将其分为4个属，其中诺如病毒(NoV)和札如病毒(SaV)两个属主要感染人类[1]，统称为人类杯状病毒(HuCV)。HuCV在全球广泛分布，是引起儿童及成人非细菌性急性胃肠炎的常见病原，自1972 年发现诺瓦克病毒[2]以来曾引起多次大的爆发流行[3-5]。诺如病毒是全球急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要致病原，疾病负担严重[6]；每年可导致约6.85亿人次急性胃肠炎发作，近30%为5岁以下婴幼儿，导致5万患儿死亡[7]。我们依托国家和吉林省CDC病毒性腹泻监测项目对住院腹泻患儿HuCV感染情况进行系统监测，现报告长春市儿童医院2013-2017年腹泻住院患儿HuCV感染病原及临床特点。

1 对象与方法

1.1研究对象2013年1月-2017年12月因腹泻住院患儿2272例。纳入标准：腹泻发病时间小于等于7天；年龄小于等于60月龄；大便以稀水样或蛋花汤样为主，每日排便次数≥3次；伴或不伴有呕吐。排除标准：腹泻大便脓血性；便常规检出大量白细胞，或脓细胞；临床高度怀疑细菌性肠炎者。

1.2方法参照国家疾病预防与控制中心病毒所“腹泻监测方案”相关方法。

1.2.1标本的采集及处理 患儿入院当天采集粪便标本约5 ml,制备成10%的便悬液，-40℃备用。

1.2.2核酸提取 采用Geneaid 病毒核酸提取试剂盒。

1.2.3HuCV核酸检测 AMV逆转录酶为 Promega 公司产品，Taq 酶、PCR反应液、RNasin 为TaKaRa 公司产品；引物序列参考“腹泻监测方案”，序列见表1。①逆转录，反应体系25 μl，包括：10xBuffer 2.5 μl，1%BSA 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 5.0 μl，25 mmol/L MgCl24.0 μl，混合 289H,I 引物(0.2 μg/μl)1.0 μl ，40 U/μl RNasin 0.1 μl，10 U/μl AMV-RT 0.35 μl ，模板RNA1.5 μl，dH2O 8.05 μl。反应条件42℃，1 h。②PCR反应体系50 μl，包括：10xBuffer 5.0 μl，25 mmol/L MgCl24.0 μl，10 mmol/L dNTPs 1.0 μl，混合 289H,I 引物(0.2 μg/μl)1.0 μl ，混合 290H,I,J,K 引物(0.1 μg/μl)1.0 μl，5 U/μl Taq 酶0.4 μl，ddH2O 29.6 μl。反应条件94℃ 3 min→(94℃ 1 min→58℃ 1 分 20 s→72℃ 1 min)×30→72℃ 10 min。

表1 人杯状病毒检测的引物序列

1.2.4结果判定 PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，NoV条带大小为 319 bp，CaV条带大小为 331 bp。

1.2.5HuCV基因型分析 应用核酸序列检测及分析方法，PCR阳性标本送测序公司进行测序，并于NCBI GenBank中NoV和CaV标准参考株比对确定基因型。

1.3统计学分析

患儿流行病学资料及实验数据采用EpiData3.1软件录入，应用Excel 2010对病例进行描述性分析，计数资料用百分率(%)表示；用SPSS 19.0 软件进行卡方检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1HuCV检出情况

2.1.1HuCV阳性检出率 2013-2017年共采集腹泻住院患儿粪便标本2272份,381份检出HuCV，HuCV总阳性检出率16.77%；2013、2014、2015、2016和2017年不同年份HuCV 阳性检出率分别为17.49%(67/383)、12.28%(55/448)、13.55%(66/487)、16.75%(67/400)和22.56%(125/554)。HuCV阳性检出率3-4年一个高峰，而且近年有增高趋势，如图1。

图1 长春市儿童医院腹泻住院患儿HuCV阳性检出率

2.1.2HuCV属和基因型 381份HuCV ，366份为 NoV，15份为SaV；NoV基因型93.17%(341/366)为GⅡ，详见表2。长春市儿童医院腹泻住院患儿杯状病毒感染可见NoV与SaV，NoV基因分组可见GⅡ、GⅠ和GⅠ/GⅡ，以NoV的GⅡ为主。

表2 2013-2017年HuCV属和基因型分布

2.2HuCV阳性患儿流行病学特点

2.2.1年龄分布 381份HuCV阳性患儿年龄最小2月龄，最大54月龄，平均年龄(15.28±10.08)月龄。长春市儿童医院腹泻住院患儿HuCV感染以7-12月龄组病人最多(36.76%),其次为13-24月龄组(32.28%)，≤24月龄组占阳性患者的83.20%，详见图2。经卡方检验，腹泻住院患儿HuCV感染年龄分布存在明显差异，χ2=13.53,P=0.019。

图2 长春市儿童医院住院腹泻患儿HuCV年龄分布

2.2.2性别分布 在2272例腹泻患儿中，男性1342例，其中HuCV感染占16.69%(224/1342)；女性930例，其中HuCV占16.98%(158/930)；腹泻住院患儿HuCV感染率男女性别无明显差异，(χ2=2.791,P=0.095)。

2.2.3城乡分布 腹泻住院城市患儿1054例，乡村患儿1218例； HuCV感染城市患儿167例，乡村患儿214例，腹泻住院患儿HuCV感染乡村多于城市，但无明显差异，(χ2=1.205,P=0.272)。

2.2.4季节分布 住院腹泻患儿HuCV感染一年四季均可发生，2013-2017年总阳性检出率一年有两个高峰，1-3月和12月，不同年份检出率有所不同，见图3；连续分析2013-2017年HuCV感染情况，2013年无明显高峰，2月和4月病例数最多；2014年2-3月、5月和12月 均出现高峰；2015年1月、4-5月和12月3个高峰；2016年1-3月和12月2个高峰；2017年1-3月和12月2个高峰；从2014年开始每年12月至次年1月-3月为腹泻住院HuCV 感染的高峰季节，见图3。

图3 长春市儿童医院腹泻住院患儿HuCV感染季节分布

2.3HuCV感染临床特征

381例腹泻住院HuCV感染患儿均有腹泻，平均每天腹泻(4.75±2.77)次。241例伴有呕吐，占比为63.25%。58.79%(224/361)伴有不同程度体温升高,其中14.44%(53/381)体温≥38.5℃。出现呼吸系统症状者占46.72%(178/381)；2.01%(8/381)出现抽搐。平均住院天数为(3.6±2.7)天。

3 讨论

我国1995年首次报道腹泻患儿粪便标本中有NLV感染[10]。HuCV是世界范围内急性病毒性腹泻的主要病原之一，是我国多数地区5岁以下小儿急性病毒性腹泻仅次于轮状病毒的致病源[11-13]；是部分地区腹泻某一时间段的第一位病原[14],多地报道HuCV感染有上升趋势[15]，这可能与近年轮状病毒疫苗的使用有关。本研究显示长春市儿童医院2013-2017年腹泻住院患儿HuCV 阳性检出率分别为17.49%、12.28%、13.55%、16.75%和22.56%,总阳性检出率为16.77%。长春市1998-2001年HuCV 阳性检出率为14%[16]，2003年-2007年HuCV阳性检出率为18%[17]，2008-2012年HuCV阳性检出率14.0%[18]。HuCV阳性检出率3-4年一个高峰，而且近年有增高趋势。长春市儿童医院腹泻住院患儿杯状病毒感染可见NoV与SaV，NoV基因分组可见GⅡ、GⅠ和GⅠ/GⅡ，以NoV的GⅡ为主。目前国内外对NoV研究较深，报道亦较多。吉林省HuCV感染也以NoV为主；SaV感染率虽然很低(3.94%)，但是呈现逐年增多趋势。以往由于SaV临床表现较NoV轻和SaV基因型的多样性，受检测方法的限制，还有SaV造成隐性感染者多极少就医，故SaV流行情况报道相对较少。近年国外对SaV流行的报道较多[19-21],目前SaV已在多个国家的急性胃肠炎病例样本中检出，检出率为1.2%-17.6%[22]。应加强对SaV流行情况的监测，深入研究其基因变化，了解其感染机制和发病机理，为可能出现的SaV暴发疫情预测和预警。

本研究长春市儿童医院腹泻住院患儿HuCV感染83.20%为≤24月龄婴幼儿，感染高发年龄段为7-12月龄组腹泻患儿，这与国内多家报道相同[15,23]。小儿生后母体的免疫球蛋白含量逐渐减少，6月后基本消失，此时自身的抗体水平也较低。这时对病原微生物感染抵抗力最小，易患各种病毒感染；2岁以内婴幼儿肠道正常菌群还没健全，生物屏障尚未形成，故≤24月龄婴幼儿为HuCV易感人群。HuCV感染男性略多于女性，乡村略多于城市。长春市儿童医院腹泻住院婴幼儿HuCV感染高发季节，2013-2017年为12月至次年1-3月；与1998-2001 年[16]和2003-2007年[17]相似；而2008-2012年为1-4月[18]。以上报道显示长春市儿童医院腹泻住院患儿HuCV感染发病高峰为寒冷季节。HuCV感染高发季节在成都是夏秋季[15]，广西是8-10月[24]。提示HuAC腹泻发病高峰不同地域存在差异。东北地区预防HuCv感染重点应在寒冷季节，同时不能忽视夏秋季食源性HuCV感染的爆发流行。

长春市儿童医院腹泻住院患儿HuCV感染的临床特点是63.25%伴有呕吐，58.79%有不同程度体温升高。提示人们：在腹泻患儿中2/3出现呕吐和发热时，应警惕HuCV感染，并做相应的检测。长春市儿童医院腹泻住院HuCV感染患儿46.72%伴有呼吸系统症状，接近深圳报道HuCV感染42.86%有呼吸系统症状[25]；2.01%(8/381)出现抽搐，国内有报道腹泻抽搐发生率约为1.78%[26]。HuCV感染多数患儿症状轻、具有自限性，也有报道婴幼儿HuCV感染出现多器官损害[25]等严重并发症。

随着分子生物学技术的发展，新的检测技术的不断涌现，HuCV的重要性和危害性逐渐被人们全面认识，通过加强HuCV感染的基础研究和流行病学监测，可为HuCV感染的预防、治疗和疫苗研发提供科学依据。