miR-30e和miR-223在肝癌患者中的检测及临床意义

孙宽学，夏红卫

(上海市浦东新区公利医院，上海200135)

近年来，具有高侵袭性及转移性的肝癌(HCC)已成为全球前三死亡率的恶性肿瘤，平均每年因HCC导致死亡的至少有60万人左右[1,2]。HCC的形成主要原因为临床感染乙肝/丙肝病毒。此外，过度饮酒、肥胖、2型糖尿病均与HCC发病密切相关[3]。目前，HCC非入侵式检查已成为主要的诊断手段。然而，对肝脏疾病发展为HCC的预测还无法实现，因此，寻找HCC发展过程中高相关性的某一指标对患者生存和治疗干预具有重要的作用。miRNA是一类具有22个核苷酸的非编码小RNA，均含有发卡的二级结构[4,5]。该类小RNA可以直接靶向mRNA对其降解或抑制转录，从而达到基因沉默的作用。选择性表达的miRNA与包括HCC在内的多种类型的肿瘤具有明显的相关性。血清miRNA已在多种疾病中报道可作为潜在的生物标记物。超过100个外周血miRNA已被验证用于不同肿瘤疾病的诊断，且该数字在不断攀升[6]。报道指出，miR-30e 可作为乳腺癌亚型特异的预后标志物之一[7,8]，且在慢性髓性白血病患者中表达较正常人群低[9]。另一方面，miR-223可作为肺癌的生物标志物进行疾病的诊断[10]。然而，目前还没有相关报道指出miR-30e和miR-223在HCC患者中的相关检测和作用机制。本次研究将探究不同发病类型的HCC患者血清中miR-30e和miR-223的表达情况，以期对该类型疾病患者非侵入生物标志物的研究提供一定的指导价值。

1 资料与方法

1.1临床资料选择2015年1月-2016年8月在我院肿瘤科就诊的HCC患者45例为观察组，其中男性32例，女性13例，年龄范围为39-88岁，平均年龄60.4±22.6岁。考虑到HCC患者感染类型不同，本次研究纳入3种HCC感染类型，包括16例HCV感染(HCV-HCC)、16例HBV感染(HBV-HCC)、13例非病毒感染(NV-HCC)患者。同时选取19例慢性肝病(CLD)和16例具有正常的氨基转移酶活性，无嗜酒，且经诊断无肝脏疾病及HBV、HCV感染阴性的健康人为对照组(HV)，其中男性11例，女性5例，年龄范围为38-69岁(平均年龄59.3±19.7岁)。各组年龄、性别、ALT和AST对比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 各组基本临床资料对比

1.2方法采集所有HCC患者和健康人的静脉血各5 mL，取上清后放于-80℃保存备用。同时收集HCC患者癌组织和癌旁组织。血清RNA通过QIAGEN miRNAeasy Mini kit试剂盒进行抽提。采用ABI公司生产的TaqMan miRNA逆转录试剂盒将提取的血清样本RNA逆转录为cDNA。合成相应microRNA的Taqman荧光探针，采用ABI公司的Step One荧光定量PCR仪对miR-30e和miR-223进行RT-qPCR。所有入组标本均重复3个复孔。本次研究的内参为U6。miRNA的相对表达水平为2-ΔΔCT。

2 结果

2.1健康人群、慢性肝病和肝癌患者血清miR-30e和miR-223的表达水平比较首先对miR-30e和miR-223的引物扩增和溶解曲线进行分析，确定其可用于本次实验(图1)。通过分析QRT-PCR检测得出miR-30e和miR-223在HV组、CLD组和HCC患者的CT值发现，HCC患者miR-30e和miR-223血清表达水平明显低于HV组和CLD组，组内对比差异具有统计学意义(P<0.05)，而HV组和CLD组相比则无明显差异(P>0.05)(图2)。

图1 U6、miR-30e和miR-223的扩增和溶解曲线

图2 HV、CLD和HCC患者血清miR-30e和miR-223的表达水平

2.2健康人群、慢性肝病和肝癌患者血清miR-30e和miR-223的ROC曲线比较miR-30e表达情况在HV和HCC(图3A)以及CLD和HCC(图3C)的ROC分析得出其AUC值分别为0.9258±0.032和0.9322±0.031，敏感性分别为89.06%和86.67%，特异性分别为81.25%和100%，cutoff值分别为0.7685和0.4755；血清miR-223表达水平在HV和HCC(图3B)以及CLD和HCC(图3D)的AUC值分别为1.000±0和0.9988±0.002，敏感性分别为100%和97.78%，特异性分别为100%和100%，cutoff值分别为和0.5095和0.4310。

2.3健康人群、慢性肝病和不同类型肝癌患者血清miR-30e和miR-223表达情况随后进一步分析发现，无论是HV组，还是CLD组，血清miR-30e和miR-223表达水平均显著高于HBV-HCC、HCV-HCC和NV-HCC组(图4)，表明不同类型的HCC患者其miR-30e和miR-223表达水平均表现出一致的下调趋势。

2.4HCV-HCC患者肝癌组织和癌旁组织miR-30e和miR-223的表达水平比较如图5A和B显示，HCV-HCC患者miR-30e和miR-223在肝癌组织中均出现明显的下调，且下调幅度与血清中HCC患者与正常人群中的比较相似。

图3 HV、CLD和HCC患者血清miR-30e和miR-223的ROC曲线

3 讨论

报道显示，HCC作为常见的恶性肿瘤之一，已成为全球高死亡率的疾病之一。研究指出，血清miRNA异常表达对癌症的发病和疾病进展起到重要的作用，因此许多研究学者认为，血清miRNA可作为肿瘤疾病的潜在非侵入性生物标志物，对临床诊断及预后诊断起到一定的帮助[11-13]。例如，miR-25、miR-184、miR-92a和miR-122分别为肺癌、鳞状细胞癌、白血病和肝损伤的筛选标志物[10,14-16]。

miR-30e在乳腺癌诊断、慢性髓性白血病发病进展和肝纤维化保护方面起到一定的作用[7-9,17]。通过预测miR-30e的靶基因发现，miR-30e能够靶向自噬相关基因(如ATG5)。自噬通路在肝脏组织的正常发育过程中起到非常重要的作用，可作为肝脏疾病的治疗靶点[18]。因此，miR-30e在HCC患者中处于抑制的状态，异常激活自噬，从而影响肝组织正常的自噬流运转。miR-223在调控细胞色素、胰岛素样生长因子1受体、微管动力中发挥关键作用，间接表明其在肿瘤增殖过程中起到重要调控作用[19-21]。有报道指出，miR-223在HCC中过表达增加抗癌药物在HCC细胞系中的敏感性[22]。本研究通过对在不同感染类型HCC患者血清miR-30e和miR-223的表达及ROC曲线分析，表明HCC患者miR-30e和miR-223表达水平下调，且具有较高的敏感性和特异性，显示血清miR-30e和miR-223可作为HCC疾病诊断的潜在生物标志物之一，同时进一步说明HCC患者细胞增殖调控紊乱。另外，在本次收集不同感染类型的HCC患者中，HBV、HCV和NV组患者的miR-30e和miR-223均出现显著的下调，且下调幅度相似，表明血清miR-30e和miR-223不受HCC感染类型的限制，提示其可作为一种HCC诊断的广谱型生物标志物，具有重要的临床诊断意义。值得注意的是，本次研究还对HCV患者癌变组织进行miR-30e和miR-223检查，结果与血清结果相似，同时结合HCC患者中较CLD与HV显著降低的结果，提示miR-30e和miR-223在HCC患者临床病理诊断、病情评估、早期诊断上有广阔的应用前景。

图4HV、CLD和不同类型HCC患者血清miR-30e和miR-223表达水平图5HCV-HCC患者肝癌组织和癌旁组织miR-30e和miR-223的表达水平

通过本次研究，我们发现miR-30e和miR-223的表达水平出现下调与HCC相关，且具有高灵敏性和特异性。同时注意到，不管是血清还是活检病理组织，均出现下调的一致性，表明miR-30e和miR-223可作为HCC无创生物标志物的潜力。后续可通过较大的队列研究进一步探究其诊断价值。