青蒿素对人结直肠癌Lovo细胞放疗敏感性的影响及其机制

邓平，陈新文

（1.湖南省张家界市慈利县人民医院 普外科，湖南 张家界 427200；2.湖南省常德市第一人民医院 普外三科，湖南 常德 415003）

结直肠癌是当今最常见的恶性疾病之一，发病率极高，严重威胁人类健康。尽管结直肠癌筛查和治疗手段的发展已提高患者预期寿命，但结直肠癌患者预后仍不理想。放射治疗常用于结直肠癌特别是直肠癌的治疗，但临床上结直肠癌放疗抵抗性发生率高，而无法获得良好的肿瘤控制率[1]。基质金属蛋白酶-9（matrix metallo proteinase-9,MMP-9）、 环 氧 化 酶 -2（cyclooxygenase-2,COX-2）及缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）等致癌基因的过表达，能够引起肿瘤细胞放疗抵抗性，而这些致癌基因表达与核转录因子-κβ（nuclear factor-κβ, NF-κβ）活性密切相关[2]。肿瘤发生发展过程中，NF-κβ激活后可以促进肿瘤细胞增殖及转移、血管新生相关致癌基因表达[3]。研究表明放化疗能够增加NF-κβ活性，进而诱导肿瘤细胞产生放化疗抵抗，这是由于NF-κβ激活后能够上调B-细胞淋巴瘤基因2（B-cell lymphoma 2, Bcl-2）、细胞型Fas结合蛋白样白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）的转换酶抑制蛋白（cellular FLICE-inhibitory protein, C-FLIP）等抗凋亡基因表达。此外，还有研究表明抑制NF-κβ活性表达可以显著增强前列腺癌、大肠癌及乳腺癌的放疗敏感性[4]。

理想放疗增敏剂应该能够增加放射线对肿瘤细胞的毒杀效果，并降低放射线对正常组织的损伤[5]。青蒿素（artemisinin, ART）是由我国研制的抗疟药，新近研究表明，青蒿素及其衍生物具有明显抗肿瘤作用[6]。青蒿素可通过抑制Bcl-2和C-FLIP表达，诱导肿瘤细胞凋亡。虽然已有研究指出青蒿素能够增强结直肠癌放疗敏感性，但作用机制仍不清楚。本研究主要探讨青蒿素能否通过抑制NF-κβ活性增强结直肠癌细胞放疗敏感 性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人结直肠癌细胞株Lovo购自中科院上海细胞生物所，培养于37℃，5%二氧化碳（CO2）细胞培养箱，所用培养液为DMEM高糖培基（含10%胎牛血清及5%青链霉素）。

1.2 细胞存活试验

将Lovo细胞以3×104的密度接种至96孔板，培养过夜后，弃去旧培基，用不同浓度青蒿素（0、10、20、30、40、50 μM）分别处理Lovo细胞培养24和48 h，移除培养液，加入浓度为1 mg/ ml的MTT溶液，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中4 h。接着移除MTT溶液，再加入20 μl DMSO，静置5 min后，检测490 nm值。

1.3 射线照射

本研究使用的直线加速器为Varian 2 100C，以12 MV X射线照射细胞，射源到表面的距离为100 cm，培养皿上方垫1.5 cm厚的组织补偿胶。

1.4 辐射照射存活曲线

将Lovo细胞以2×106的密度接种至10 cm细胞培养皿，培养过夜后，将细胞随机分为4组：对照组（0.1%DMSO）、单独处理放射线组、放射线结合青蒿素组、放射线结合NF-κβ抑制剂组，放射剂量分别为 0、2、4、6、8、10 Gy，青蒿素浓度为30 μM，NF-κβ抑制剂6氨基喹唑啉（6-amino-4-quinazoline, QNZ） 浓 度 为 20 nM。细胞在射线照射后立即加入青蒿素或NF-κβ抑制剂干预，24 h后，胰蛋白酶消化细胞，并根据放射剂量，调整种到细胞培养皿的细胞数目，继续培养14 d后，固定细胞液（甲醇/冰醋酸）10 min后清洗，再加入4%结晶紫并静置10 min，清洗后用光学显微镜观察，细胞克隆中包含的细胞数目要大于50个，根据下列功能计算细胞存活率。种植效率=（观察到的克隆数目/植入的细胞数量） ×100%，存活率=观察到的克隆数目/［植入的细胞数量×（种植效率/100%）］。

1.5 DNA碎片化实验

将Lovo细胞以2×106的密度接种至10 cm细胞培养皿，培养过夜后，将细胞随机分为6组：对照组（0.1% DMSO）、放射线组（6 Gy）、青蒿素组（30 μM青蒿素）、抑制剂组（20 nM QNZ）、青蒿素联合放射线组（30 μM青蒿素结合放射线处理）、抑制剂联合放射线组（20 nM QNZ结合放射线处理），接着培养24或48 h后，用胰蛋白酶将细胞消化并收集至1.5 ml离心管中，提取细胞基因组DNA，行1%的琼脂糖凝胶电泳。

1.6 细胞总蛋白提取

将细胞数为2×106的Lovo细胞株培养在的10 cm的细胞培养盘中，经24 h的细胞贴附静置后，细胞被随机分成6组：对照组（0.1% DMSO）、放射线组（6Gy）、青蒿素组（30 μM青蒿素）抑制剂组（20 nM QNZ）、青蒿素联合放射线组（30 μM青蒿素结合放射线处理）、抑制剂联合放射线组（20 nM QNZ结合放射线处理），接着培养24或48 h后，提取细胞总蛋白。

1.7 蛋白质免疫印迹检测

取对照组、放射线组、药物组、药物联合放射线组各组蛋白40 μg，行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离不同分子量蛋白质，将胶体上蛋白质转印至PVDF膜。转膜完成后，将PVDF膜用封闭液（0.12M Tris-base，1.5M NaCl，0.1%Tween-20，和5%w/v脱脂牛奶）作用4 h，再加入一抗并置于冰箱中过夜，第2天以TBST（0.12 M Tris-base，1.5 M NaCl和0.1% Tween-20）清洗，再加入二抗并置于室温1 h，以TBST清洗，再ECL显色，Image J软件定量分析实验结果。一抗包括：NF-κβ、p-NF-κβ、Bcl-2、C-FLIP、β-actin。

2 结果

2.1 青蒿素抑制Lovo存活率及pNF-κβ、Bcl-2和C-FLIP的变化

细胞毒性试验发现，青蒿素可以显著抑制Lovo生长，且呈时效性和剂效性（图1A）。干预24 h后，青蒿素对Lovo的半抑制浓度（IC 50）约为30 μM，故后续实验中所使用的青蒿素浓度均为30 μM。青蒿素通过诱导凋亡抑制Lovo增殖（图1B）。

为了探讨青蒿素影响Lovo细胞增殖的分子机制，本研究分析了转录因子NF-κβ蛋白质活性及凋亡相关蛋白Bcl-2和C-FLIP的表达变化情况，结果显示30 μM青蒿素干预Lovo 24 h后，磷酸化NF-κβ（p-NF-κβ）、Bcl-2和C-FLIP蛋白表达抑制比率分别为50%、40%与60%；而干预48 h后，蛋白表达抑制比分别为80%、70%与90%，结果同样显示30 μM青蒿素显著抑制Lovo细胞p-NF-κβ、Bcl-2和C-FLIP表达（图1C）。

2.2 抑制NF-κβ增强Lovo细胞的放疗敏感性

为探讨NF-κβ活化对Lovo细胞放疗敏感性的影响，本研究采用NF-κβ抑制剂QNZ药物干预Lovo细胞，结果显示与单独射线处理相比，联合NF-κβ抑制剂处理Lovo细胞的存活率更低（图2A），同时促进细胞凋亡（图2B）。

与单独射线组处理相比，在联合NF-κβ抑制剂与放射线组，细胞色素C（cytochrome-C）与半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）的表达显著增加，而Bcl-2与C-FLIP表达显著降低（图2C），提示NF-κβ抑制剂可促进放射线诱导细胞凋亡的cytochrome-C和casapase-8蛋白表达，同时抑制因放射线刺激而抗凋亡蛋白Bcl-2和C-FLIP表达。

2.3 青蒿素增强结直肠癌细胞对放疗敏感性和抑制NF-κβ活性

进一步评估青蒿素联合射线对Lovo细胞增殖和NF-κβ调控抗凋亡机制。结果表明，与射线单独处理相比，青蒿素联合射线处理更显著地降低Lovo细胞的存活率（图3A）。图3B显示与NF-κβ抑制剂干预相似的是，青蒿素干预能够增加放射线诱导Lovo细胞凋亡的DNA断裂。当NF-κβ磷酸化增加时，提示NF-κβ可以进入细胞核内，并且调控下游致癌基因转录表达。图3C表明射线可以增强p-NF-κβ表达，而青蒿素具有降低射线诱导NF-κβ磷酸化的能力，且青蒿素也能抑制射线上调抗凋亡蛋白质Bcl-2和C-FLIP表达的能力，同时增加凋亡蛋白cytochrome-C和casapase-8释放。

图1 青蒿素对结直肠癌细胞株（Lovo）增殖、凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响

图2 NF-κβ抑制剂增加射线对Lovo细胞的杀伤效果

图3 青蒿素增加结直肠癌细胞株（Lovo）的放疗敏感性，并抑制NF-κβ活性

3 讨论

肿瘤产生抗性是目前临床治疗肿瘤的最大挑战，许多造成肿瘤抗性的致癌基因就是由转录因子NF-κβ调控激活，临床研究证明，肿瘤组织内NF-κβ表达越高，肿瘤抗性发生风险越高，患者愈后也就越差[7]。青蒿素是从黄芫花植物青蒿中提取的一类倍半萜制剂，主要用于治疗对喹啉耐药的顽固性疟疾。美国国立卫生研究院的研究结果显示，青蒿素对白血病、大肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌细胞均有抑制作用。文献指出，青蒿素具有抗NF-κβ活性功能，以往研究表明青蒿素可以增强结直肠癌细胞的放疗敏感性，但并不清楚其作用机制是否与青蒿素抑制NF-κβ的活性有关[8]。因此，本研究拟探讨青蒿素通过调控NF-κβ活性对结直肠癌细胞放疗敏感性的影响。

细胞内NF-κβ分子路径分为典型和非典型路径，典型路径是指由p65和p50两种亚基组成的异质性蛋白存在于细胞质内，其活性被NF-κβ抑制蛋白激酶（I kappaB）所抑制，而射线能够引起NFκβ抑制蛋白激酶分解，使NF-κβ活化进入细胞核内，转录激活下游抗凋亡基因。研究表明特异性抑制NF-κβ活性可以显著增加大肠癌的放疗敏感性[9]，本研究也证实了这一结果，常见的NF-κβ抑制剂QNZ可以增强放射线对结直肠癌细胞增殖的抑制作用，特别是4-10 Gy间剂量的射线。

Bcl-2和C-FLIP由NF-κβ调控的抗凋亡基因，大量表达于恶性肿瘤，当放射线刺激激活肿瘤NF-κβ时，也能促进Bcl-2和C-FLIP表达[10]。本研究结果显示放射线可以上调Bcl-2和C-FLIP表达，而NF-κβ抑制剂可以降低放射线诱导Bcl-2和C-FLIP表达的能力。

细胞凋亡路径可以分成线粒体和非线粒体相关的细胞凋亡途径。发生线粒体凋亡路径的主要原因是线粒体膜电位下降，导致cytochrome-C和其他造成细胞凋亡路径活化调控因子释放[11]。而发生非线粒体细胞凋亡途径的主要原因是细胞膜外死亡受体激活，不同死亡受体被不同配体所激活，但是这些不同的死亡受体启动细胞凋亡路径必定会造成caspase-8裂解而显示活性[12]。Bcl-2的功能是稳定线粒体膜电位，C-FLIP干扰caspase-8裂解，所以这两种蛋白质表达阻止细胞凋亡发生，反之降低这两种蛋白质表达则可使细胞凋亡顺利进行。本研究显示，NF-κβ抑制剂抑制Bcl-2和C-FLIP表达，促进放射线诱导cytochrome-C释放和caspase-8裂解，提示抑制肿瘤内NF-κβ活性后，放射线可通过线粒体和非线粒体途径促进细胞凋亡发生，从而杀伤Lovo细胞。此外，本研究还发现NF-κβ抑制剂联合放射线能够促使Lovo细胞DNA断裂，DNA断裂是细胞凋亡的特征之一。

青蒿素除了抗疟疾作用外，还具有抗癌、抗感染及抗氧化等功能，可以通过抑制细胞内许多不同的信号传导蛋白质从而减少疾病发生。多项研究还表明，青蒿素还可抑制多种癌细胞内NF-κβ活性及NF-κβ调控的致癌基因表达[13-14]。本研究发现随着青蒿素干预时间延长，Lovo细胞中NF-κβ活性及NF-κβ调控的致癌基因表达下降越显著。由于青蒿素的NF-κβ抑制作用，故可联合放化疗增加放化疗的抗癌效果。以往有研究表明青蒿素增强肺癌、乳腺癌及胶质瘤等肿瘤的放疗敏感性，但是其具体机制尚不清楚。目前尚未见青蒿素对结直肠癌放疗敏感性的相关研究。本研究显示，Lovo曝露于青蒿素结合放射线处理组的存活百分率明显低于单独放射线处理组的细胞。在图3B中显示青蒿素可以降低放射线激活Lovo的NF-κB活性，且相似于图2C中受NF-κB抑制剂处理后而抑制的Bcl-2和C-FLIP的蛋白表达，同时通过增加cytochrome-C和caspase-8而增强放射线诱导Lovo产生细胞凋亡。本研究结果表明青蒿素能够通过抑制NF-κB活性提高结直肠癌细胞Lovo的放疗敏感性。