丹红合剂保护脑缺血再灌注损伤的机制研究

郑君 陈少秀 张晓春

[摘要] 目的 研究丹红合剂对脑缺血-再灌注损伤的保护作用机制。 方法 将48只符合改良局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO）的SD大鼠按随机数字表法分为MCAO組、阳性药组（奈必洛尔）和观察组（丹红合剂），每组各16只，干预1周。分别在干预前后进行Longa神经学评分，测量脑梗死体积并检测脑梗死组织中NO、一氧化氮合成酶（eNOs）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和Ca2+含量；比较干预前后大脑皮质小胶质细胞中内皮素-B（ET-B）受体及梗死区脑组织血管内皮生长因子（VEGF）蛋白及其基因表达。 结果 与干预前比较，观察组干预后NO、eNOs、SOD、VEGF-mRNA、VEGF蛋白表达和Longa神经学评分升高，MDA、ET-B蛋白、ET-B-mRNA表达、Ca2+量及梗死体积均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。干预后，观察组上述指标与MCAO组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。观察组VEGF-mRNA、VEGF蛋白表达、MDA和SOD水平与阳性药组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 丹红合剂对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

[关键词] 丹红合剂；脑缺血再灌注损伤；氧化应激；神经功能

[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（c）-0016-04

[Abstract] Objective To study the protective mechanism of Danhong Decoction on cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods The 48 SD rats were divided into MCAO group， positive drug group （Nebivolol） and observation group （Danhong Decoction） by random number table， with 16 cases in each group， which were in accordance with the modified focal cerebral ischemia reperfusion model （MCAO）. They were intervened for one week. Before and after intervention， Longa neurological scores were taken to measure cerebral infarct volume and NO， nitric oxide synthase （eNOs）， superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in cerebral infarct tissue and Ca2+ content were detected. The endothelin-B （ET-B） receptors in cerebral cortical microglia and the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） protein and its gene in infarcted brain tissue were compared. Results After intervention， the levels of NO， eNOs， SOD， VEGF-mRNA， VEGF protein and Longa neurological score in the observation group were increased， while the levels of MDA， ET-B protein， ET-B mRNA， Ca2+ and infarct volume were decreased， with statistically significant differences （P < 0.05）. After intervention， the differences of those indices between the observation group and the MCAO group were statistically significant （P < 0.05）. Besides， the differences of VEGF-mRNA， VEGF protein， MDA and SOD levels between the observation group and the positive drug group were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Danhong Decoction has a protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury.

[Key words] Danhong Decoction； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Oxidative stress； Neurological function

急性脑梗死具有起病急骤和致死致残率高的特点，经溶栓干预后患者神经功能多因“脑缺血-再灌注损伤”及“氧化应激”而严重受损[1-2]。丹参味辛、性凉，主治心脑腹痛，红花味辛、性温，善通利经脉，两者兼用具有“活血化瘀、通经祛瘀”之功率[3]。两者复方制剂如丹红注射液在临床防治心脑血管系统疾病已有应用并取得了较好的临床效果[4]。本研究用太和医院自制的“丹红合剂”对MCAO模型大鼠进行干预，观察其对脑缺血再灌注后“氧化应激”对血管内皮功能及神经功能恢复的影响，现将实验结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性健康SD大鼠70只，8周龄，体质量（275±5）g，湖北医药学院动物中心提供，許可证号为SCXK（鄂）2017-0008。动物的使用符合3R原则，给予人道关怀，实验前适应性饲养1周。造模后分笼饲养，大鼠自然光照，自由饮水及进食（普通饲料），动物房湿度（70～80）%，温度（22～24）℃。

1.2 药品与试剂

丹红合剂由太和医院中药房提供（批号：THYF17 0923）；水合氯醛购自扬州市奥鑫助剂厂（批号：302-17-0）；鼠抗人一氧化氮合成酶（eNOs）和血管内皮生长因子（VEGF）检测用ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：S01712、S01743）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及NO ELISA试剂盒（上海劲马生物科技有限公司，批号：H1094、H1103、H1067）；内皮素-B（ET-B）多克隆抗体及RT-PCR 检测试剂盒（艾美捷科技有限公司，批号：01803、018214）。

1.3 MCAO模型制备、分组及干预

10%水合氯醛麻醉大鼠，仰卧位固定四肢和门齿，消毒后纵行切开颈正中皮肤，钝性分离出颈内动脉及颈外动脉。结扎颈外动脉，沿颈内动脉向远心端分离出进入颅内的翼腭动脉，然后分别用微动脉夹夹闭翼腭动脉远心端和颈内动脉近心端，在紧靠颈内动脉近心端剪一小口，用栓线小心插入，当栓线到达翼腭动脉微动脉夹夹闭处时，松开微动脉夹，缓慢推进，当手感遇到阻力即可，栓线阻断供血90 min后抽出以恢复大脑血流[5]。造模成功标准[6]：术后12 h以Longa神经学评分在1～4分的为造模成功。分组：剔除造模后死亡及蛛网膜下腔出血的22只，将48只造模成功的大鼠按随机数字表法分均为MCAO组、阳性药组和观察组（n = 16）。干预：均采用2次/d灌胃方法给药，共干预1周。其中MCAO组用90%NaCl灌胃对照，阳性药组用0.05%奈必洛尔灌胃对照，观察组用2%丹红合剂（1 mL/鼠）灌胃。

1.4 观察指标

采用Griess法检测脑组织NO相对表达量；采用Western blot法检测脑组织eNOs相对表达量；采用酶联免疫吸附法检测干预前后梗死区脑组织匀浆液SOD及MDA含量；免疫荧光双标染色法检测大脑皮质小胶质细胞中内皮素-B（ET-B）受体及梗死区脑组织VEGF的蛋白表达，实时定量（RT-PCR）检测VEGF和ET-B受体mRNAR表达，PCR扩增引物序列用pfimer5软件设计，检测时先用RNA抽提试剂盒提取梗死区脑组织中总RNA并逆转录合成cDNA；配制PCR的总反应体系，以GAPDH为内参，PCR扩增后RT-PCR分析VEGF和ET-B受体mRNAR表达水平。其中VEGF基因上游引物：5′-ACAGGCATCGCCTACGCTAC-3′，下游引物：5′-GCATCCTCTAGCTG-ACGCACG-3′。ET-B基因上游引物：5′-CACTCCTGATGATTCCTGTACT-3′，下游引物：5′-ACTCGGTC-ACTGTCCGATC-3′。GAPDH上游引物：5′-ACTACCTGGATACCATCGACTAC-3′，下游引物：5′-CTAACCCTAGCGGATGGTC-3′。PCR反应条件：95℃预变性2 min，95、52、72℃各30 s，扩增47个循环。使用curve expert 1.3软件绘制上述样本标准曲线（以OD值为纵坐标、标准品的浓度为横坐标），以目的基因灰度值/GAPDH灰度值表示VEGF mRNAR及ET-B mRNAR的表达值，读取上述VEGF mRNAR及ET-B mRNAR浓度。比较脑梗死组织的Ca2+含量和梗死体积，并对各组干预前后进行Longa神经学评分以比较干预对神经功能的影响。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，各组间先采用Levene检验方差齐性，当方差齐时采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；方差不齐时采用随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹红合剂对ET-B、VEGF蛋白及两者mRNA表达的影响

MCAO组ET-B蛋白和ET-B mRNA表达干预后升高（P < 0.05）；VEGF蛋白及VEGF mRNA与干预前比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。阳性药组ET-B蛋白和ET-B mRNA干预后明显度降低（P < 0.05）；但VEGF蛋白及VEGF mRNA干预前后无明显变化（P > 0.05）。观察组ET-B蛋白和ET-B mRNA干预后有一定程度降低，且低于干预后MCAO组，差异有统计学意义（P < 0.05）；VEGF蛋白及VEGF mRNA明显高于干预前及干预后MCAO组和阳性药组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 丹红合剂对NO、eNOS、MDA和SOD的影响

与干预前比较，MCAO组NO、eNOS和SOD干预后降低，MDA明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与干预前和干预后MCAO组比较，阳性药组eNOs及NO显著升高（P < 0.05），但MDA和SOD无明显变化（P > 0.05）。与干预前比较，观察组干预后eNOs、NO和SOD均升高，MDA降低；且eNOs和NO高于干预后MCAO组，SOD高于干预后MCAO组和阳性药组，MDA低于MCAO组和阳性药组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 丹红合剂对梗死区脑组织含Ca2+量、梗死体积和Longa神经学评分的影响

与干预前比较，阳性药组和观察组Ca2+量、梗死体积和Longa神经学评分均降低，且均低于干预后MCAO组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

生理状态下，血管内皮细胞分泌血管活性物质NO和内皮素-1（ET-1）。ET-1属缩血管因子，而NO属舒血管因子，NO在eNOs的崔化作用下产生，对血管具有舒张作用[7-9]。动物实验表明，NO在脑缺血-再灌注后释放明显减少，而ET-1明显增多，调节血管舒缩平衡稳态关系因此失衡，这会导致血管内皮功能紊乱而加剧脑缺血-再灌注损伤[10-12]。ET-B受体广泛存在于血管内皮，是ET-1的一种G蛋白偶联受体，在缺血缺氧时可大量诱发，故ET-B蛋白及ET-B-mRNA高表达预示血管内皮损伤严重，而两者表达降低则预示脑缺血现象得以改善和纠正[13-14]。除上述血管活性物质参与脑损伤外，“氧化应激”反应也是造成缺血再灌注损伤，如氧自由基、MDA等均是引起的“氧化应激”反应的重要分子机制。过度的“氧化应激”反应会增加神经细胞胞质内Ca2+浓度，减少NO生成而使血管舒张减弱。同时，Ca2+内流会消耗ATP，后者减少又会损伤内皮细胞而加重脑损伤[15]。但血管内皮损伤具有可逆性，故可应用血管和神经保护剂如应用钙离子拮抗剂、自由基清除剂及中医药干预等防治和修复损伤内皮[16]。增加SOD和促血管新生因子VEGF，清除氧自由基及脂质过氧化产物MDA，抑制“氧化应激”反应，促进缺血区血管新生以增加脑血流量，这对促进神经突触增生及缺血大脑神经重塑具有重要意义[17-18]。

在本实验中，丹红合剂在促进eNOs活化、刺激内皮细胞释放NO、降低ET-B及其-mRNA表达、拮抗Ca2+内流、防止Ca2+超载等方面与β1肾上腺素受体阻滞剂奈必洛尔相似，但弱于奈必洛尔。但丹红合剂在其他方面具有奈必洛尔所不具备的功能，如降低MDA、提高SOD的合成，这可以抑制和消除氧自由基及脂质过氧化反应对血管内皮的伤害性刺激，抑制“氧化应激”而发挥脑缺血-再灌注损伤的保护作用。另外，丹红合剂还具有提高willis动脉环VEGF-mRNA和VEGF蛋白表达，这有利于缺血区血管新生、增加脑血流量，促进神经突触增生及缺血大脑神经重塑，实验中观察到观察组ET-B蛋白及ET-B-mRNA表达降低就足以证实脑缺血现象得以改善和纠正。观察还发现丹红合剂可降低梗死区脑组织含Ca2+量的作用，这一作用与其对急性心肌梗死的机制相似，可能是丹红合剂中的丹参的主要有效成分丹参酮ⅡA发挥拮抗Ca2+内流的作用，因Ca2+内流会消耗ATP，使ATP减少，故丹参拮抗Ca2+内流可减少ATP的消耗，这可减少内皮细胞损伤，减轻脑缺血-再灌注损伤造成的脑损伤[19-20]。从实验结果来看，丹红合剂在改善Longa神经学评分和降低梗死体积方面与奈必洛尔相似，说明丹红合剂具有改善脑损伤神经功能的作用。

综上所述，丹红合剂除具有与奈必洛尔相似的提高NO、eNOs合成、降低ET-B及其-mRNA表达、防止Ca2+超载而保护缺血区脑血管内皮细胞、促进脑神经功能恢复外，还可通过抑制氧化应激反应、提高VEGF-mRNA和VEGF蛋白表达而促进梗死区血管新生，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

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