海南某规模牛场口蹄疫强制免疫效果分析

施力光 刘诚 彭维祺 胡海超 侯冠彧

摘 要 口蹄疫是我国规定强制免疫的动物疫病。为了评价口蹄疫疫苗强制免疫疫果，本研究采用液相阻断ELISA法检测了海南儋州某规模牛场强制免疫口蹄疫疫苗三价苗前后的免疫抗体水平。结果表明：强免口蹄疫三价灭活苗21 d后，试验牛血清O型、A型和亚Ⅰ型抗体效价和免疫合格率均达到规定标准；O型和A型免疫效果优于亚Ⅰ型免疫效果，而且肌肉注射效果优于皮下注射效果。

关键词 肉牛 ；口蹄疫 ；免疫效果 ；液相阻断ELISA法

中图分类号 S858.23 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.04.020

Abstract Foot-and-mouth disease （FMD） is an animal disease provided for compulsory vaccination in China. In order to evaluate the compulsory immunity effects of FMD vaccine in beef cattle， the antibody level of the beef cattle in a beef cattle farm was monitored before and after the beef cattle was inoculated compulsorily with trivalent inactivated vaccine by using the liquid phase blocking ELISA assay in Danzhou， Hainan. The results showed that the antibody level and immunity of the beef cattle against FMD virus types O， A and Asia I were consistent with the standards required after the beef cattle were inoculated for 21 days. The immune effect of the FMD virus types O and A was better than that of the type Asia1 in the beef cattle， and the intramuscular injection had better effect than the hypodermical one.

Keywords beef cattle ； foot-and-mouth disease ； immune effects ； liquid phase blocking ELISA

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄动物的急性接触性传染病，具有发病快、时间短、范围广的流行病学特征[1]。我国将口蹄疫列为一类动物传染病。迄今为止，至少有7种血清型的口蹄疫病毒已被分离鉴定，包括O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型等[2]。目前预防口蹄疫病毒感染的最有效方式是通过接种疫苗，灭活的FMDV能在黏膜组织和血清中产生特异性抗体反应，并伴随Th1/Th2反应[3]。农业部下发的口蹄疫的免疫方案明确规定，对所有牛进行O型和亚洲Ⅰ型口蹄疫的强制免疫。海南作为全国建成的首个“无规定动物疫病区示范区”，根据《海南省无规定动物疫病区管理办法》，也对口蹄疫、高致病性禽流感、猪瘟、鸡新城疫、高致病性猪蓝耳病、狂犬病等6种动物疫病实施强制免疫，而且免疫密度和免疫效果应当达到国家和海南省规定的标准。为了评价口蹄疫疫苗强制免疫效果，本研究對海南儋州某规模牛场强化免疫O型、A型和亚洲Ⅰ型口蹄疫疫苗三价苗后免疫抗体消长情况进行检测，以期为规模化牛场口蹄疫免疫提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

于海南省儋州市境内某规模肉牛场随机选取健康无病、体重相近的12～15月龄的海南黑牛（和牛×海南黄牛）40头作为试验动物，随机分成2组，Ⅰ组和Ⅱ组，每组20头，编号后按照常规饲养条件混群饲养。

1.1.2 强免疫苗

试验所用疫苗购自某正规厂家生产的口蹄疫O型、A型、亚Ⅰ型三价灭活疫苗，接种途径和免疫剂量按照疫苗说明书操作。

1.1.3 抗体检测试剂

试验所用O型、A型、亚Ⅰ液相阻断ELISA试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.2 方法

1.2.1 强免接种

按照疫苗生产厂家推荐的接种剂量，所有试验牛于同一时间进行强免接种，其中免疫试验Ⅰ组于颈部皮下注射3 mL，试验Ⅱ组于臀部肌肉注射3 mL。

1.2.2 血样采集

试验过程中对30头试验牛共采血5次，采血时间点为强免接种前（0 d）、强免后21、40、60和80 d，颈静脉采血法用真空管采集血样，室温静置15 min，待析出血清后，于4℃、2 500 r/min条件下离心15 min分离血清，用以测定抗体滴度。

1.2.3 抗体效价检测

按照液相阻断ELISA试剂盒操作说明提供的方法分别检测试验牛血清中口蹄疫A型、O型、亚洲Ⅰ型抗体效价。根据《2017年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》规定执行，三种口蹄疫抗体效价≥26为合格。

2 结果与分析

2.1 A型口蹄疫抗体效价

试验牛强免O型、A型、亚Ⅰ型三价灭活疫苗后，A型口蹄疫抗体效价检测结果如表1所示。A型抗体强免前抗体滴度为1∶101，抗体合格率95%以上，试验牛基础抗体水平符合国家和本省规定的免疫标准。采用肌肉注射或皮下注射强免后，A型抗体滴度显著上升，免疫后21 d合格率为100，到40 d合格率也在95%以上；强免后60 d抗体滴度开始显著降低，合格率也降至80%，到强免后90 d抗体已降至较低水平，见表1。

2.2 O型口蹄疫抗体效价

采用不同注射方法强免口蹄疫三价苗后O型抗体消长情况如表2所示，强免前基础抗体滴度和合格率都在较高水平。强免后O型抗体维持时间较长，肌肉注射组试验牛在90 d后都能保持较高的抗体滴度和合格率。皮下注射组在免疫后60 d也能保持较高的抗体效价，90 d出现明显下降，见表2。

2.3 亚Ⅰ型口蹄疫抗体效价

强免前，试验牛亚Ⅰ型抗体滴度较低，合格率也不到60%，强免后亚Ⅰ型抗体效价上升快，维持时间长，合格率达到90 d以上。采用肌肉注射强免后抗体滴度略低于皮下注射后的滴度峰值，但滴度降低缓慢，能维持较长时间的高抗体活性，见表3。

3 讨论

按照《国家中长期动物疫病防治规划（2012～2020年）》要求，农业部《2017年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》明确规定，无疫区（海南）每年开展1至2次口蹄疫监测，抗体效价≥26（1∶64）为免疫合格个体。本研究中规模牛场强免试验前O型、A型抗体平均滴度分别为1∶123，1∶101，免疫合格率均在90%以上，达到国家和本省规定的标准，表明试验用肉牛已实施过口蹄疫大防，且免疫效果较为理想。而亚Ⅰ型抗体效价略低于O型和A型抗体（滴度为1∶83），免疫合格率仅为58%，可能原因是与大防免疫口蹄疫疫苗有关，因为在灭活疫苗中，完整FMDV粒子（146S粒子）是至关重要的免疫抗原，它的数量和稳定性决定了疫苗的免疫效果[4-5]，亚Ⅰ型免疫特异性不强或者是未接种亚Ⅰ疫苗都可能造成抗体效价存在较大差异。

本研究强制免疫口蹄疫三价疫苗后，亚Ⅰ型抗体在免疫后21 d抗体效价显著上升，且免疫效果持续时间长，与李旭蓉等[6]、周静华等[7]开展的口蹄疫免疫接种效果评价结果相似。在免后90 d仍能达到70以上的免疫合格率，表明该疫苗对亚Ⅰ型口蹄疫有较好的免疫效果，也说明海南黑牛对亚Ⅰ型口蹄疫疫苗的免疫应答反应强，从而使免疫抗体保持在较高的水平。李平花等[8]通过Asia1型口蹄疫病毒受体结合位点多样性研究证实，含RGD受体结合位点为优势的FMDV种群，Asia1潜在的受体结合基序对FMDV的细胞识别和宿主嗜性的改变以及免疫效果提高起到关键作用。同样，试验牛对O型抗体也有较理想的免疫效果，在强免后90 d仍能保持不低于75%的免疫合格率。邵军军等[9]指出，可通过增加抗原表位、引入外源载体蛋白或T细胞表位等方法提高表位肽的免疫原性；杨亮等[10]通过对牛O型口蹄疫病毒Vp1蛋白上的B表位和T表位模拟结构进行验证获得理想的免疫效果。从强免后的试验结果看，A型抗体较O型和亚Ⅰ型抗体滴度都要低，与贺奋义等[11]报道的结果一致。强免后40 d检测到滴度显著上升，但抗体效价在强免后60 d即出现了较明显的消退，表明A型口蹄疫需要再进行二次免疫，以加强保护效果。

免疫程序和免疫方法对免疫效果有决定性的影响[12-13]。本研究中采用肌肉注射和皮下注射2种不同免疫接种方法，在强免后21 d都检测到抗体效价达到较高水平，随着时间的延长，采用肌肉注射接种疫苗后的抗体水平要比皮下注射后抗体水平下降缓慢，尤其是在O型和亚Ⅰ型抗体滴度消长规律中表现的更为明显，而且肌肉注射接种的试验牛免疫合格率高于皮下注射组，这与卫龙兴等[14]在奶牛口蹄疫免疫试验中的结果基本一致。另外，在本研究过程中，还发现皮下接种后个别试验牛出现起包的现象，容易造成体表创伤化脓。韩惠瑛等[15]通过观察肉牛免疫口蹄疫双价苗抗体消长情况，证实口蹄疫疫苗一次接种免疫抗体合格率和免疫效果均低于二次、三次免疫的效果。因为特异性免疫中，机体再次受到特定抗原刺激时，记忆细胞会更迅速分裂效应T细胞和浆细胞来对抗抗原。本研究中A型口蹄疫抗体效价在强免后的60 d就出现了较大幅度衰减，如能针对性地进行一次补免或强化免疫，抗体效价和合格率将会显著延长和提高，达到更好的免疫效果。

4 小结

综上所述，本研究采用液相阻断ELISA法检测海南儋州某规模牛场强制免疫口蹄疫疫苗三价苗前后的免疫抗体水平，强免前该场肉牛O型和A型抗体水平较高，亚Ⅰ型免疫效果较差。采用不同方法统一强免后，抗体效价滴度均有明显上升，而且肌肉注射效果优于皮下注射效果，但不同类型抗体消长规律不尽一致，针对性地在60～90 d进行一次补免或强化免疫能达到更好的免疫效果。

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