2017年度人EGFR基因突变检测试剂盒抽验质量分析

孙楠 于婷 黄杰 曲守方

人表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区以及胞内区组成。其中胞内区为酪氨酸激酶功能区，由EGFR的18～24号外显子编码。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶区域的前4个外显子上（18～21），其中外显子19和外显子21突变最为常见，是EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）的敏感性突变［1-3］。而发生在外显子20上的T790M突变为EGFR-TKI耐药突变［4］。目前，EGFR-TKI是非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）治疗中研究最多、证据最充分、应用最广泛的分子靶向治疗药物。因此，了解EGFR基因突变状态是临床衡量肿瘤患者对EGFR-TKI疗效的最重要手段。

针对EGFR基因突变检测方法有直接测序法（sanger sequencing）、探针扩增阻滞突变系统法（amplification refractory mutation system，ARMS）、荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization，FISH）［5］、高分辨熔点曲线分析法（high resolution metling，HRM）［6］、变性高效液相色谱技术（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）［7］、数字PCR（digital PCR）［8］以及二代测序（next-generation sequencing，NGS）等［9］。 其中，直接测序由于技术的可靠性以及相对简单的操作使其成为基因突变检测的“金标准”［10］。ARMS荧光定量PCR法是检测EGFR基因突变最常用的方法［11］。目前我国有很多企业研制针对EGFR基因突变检测的诊断试剂盒，主要用于检测人EGFR基因中的18-21外显子上的常见突变。然而，各厂家试剂盒质量参差不齐，不能完全满足临床诊断需求。因此，本文对抽样的8家企业9批次EGFR基因突变检测试剂盒进行检测，分别采用各企业参考品以及国家参考品对抽检试剂盒进行性能评估，以期了解各厂家研制的EGFR基因突变检测试剂盒质量情况。

1 材料与方法

1.1 材料

从8家使用单位和生产企业（武汉海吉力生物科技有限公司；厦门艾德生物医药科技股份有限公司；益善生物技术股份有限公司；北京雅康博生物科技有限公司；无锡市锐奇基因生物科技有限公司；上海源奇生物医药科技有限公司；武汉友芝友医疗科技股份有限公司；江苏为真生物医药技术股份有限公司）共抽检到9批次的“人EGFR基因突变检测试剂盒”，用于本研究抽验对象。其中荧光PCR法8批次，流式荧光杂交法1批次。同时由各单位提供企业参考品用于评价抽检试剂盒是否符合该生产厂家的注册标准。

使用临床样本来源的人类EGFR基因突变检测统一参考品，用于探索性研究测试本次抽检的5个批次试剂盒。该参考品浓度为2 ng/μL，通过已获注册证的EGFR试剂盒（厦门艾德生物医药科技股份有限公司）对临床样本进行初筛，再用Sanger测序法进行确认突变位点信息。该参考品包括：①阳性参考品P1-P7，来源于7例非小细胞肺癌患者的FFPE样本，经Sanger测序验证具有相对应的EGFR基因突变位点，突变类型包括19-Del、L858R、T790M、20-ins、G719X、S768I、L861Q。②阴性参考品N1-N3，来源于3例临床上经过Sanger测序法检测EGFR基因突变均为阴性的非小细胞肺癌患者的FFPE样本。③检测限参考品L1-L21，经数字PCR定量确定突变比率为1%的样本。④重复性参考品P1-P3，P1为野生型样本、P2和P3分别具有EGFR19-Del突变以及S768I突变的样本。

1.2 方法

1.2.1 以企业注册标准/产品技术要求检验

采用各企业提供参考品，分别检测对应抽检的检测试剂盒。所有检验均按照企业注册标准/产品技术要求进行，检验项目包括准确性（阳性参考品符合率）、特异性（阴性参考品符合率）、检测限和重复性。操作步骤严格按照各企业检测试剂盒说明书的要求进行，最后对实验结果进行判定。

为了验证抽验试剂盒的有效性，选取一家生产厂家的抽检试剂盒（荧光PCR法），分别从不同抽样环节、不同适用机型以及不同样本类型进行检测，对比分析不同条件下试剂盒的准确性、特异性、检测限以及精密度。①从生产环节和使用环节抽取相同批号的试剂进行测定；②根据其说明书中适用机型，分别选取PCR测定仪Stratagene Mx3000P（Agilent，美国）和PCR测定仪ABI-7500（Life Tech，美国）进行测定；③针对检测样本适用于组织样本和外周血样本，分别设置最低检出限要求进行测定（病理组织样本在10 ng/μL野生型基因组DNA背景下，对突变DNA含量为5%的检测限参考品能够准确检出；外周血样本在突变DNA含量为10%背景下，对DNA浓度为1 ng/μL的检测限参考品能够准确检出。）

1.2.2 探索性研究

采用人类EGFR基因突变检测统一参考品对本次抽验的5个EGFR检测试剂盒进行探索性研究。参照产品行业标准《人类EGFR基因突变检测试剂盒》［12］报批稿的要求，同时进行准确性（阳性符合率）、特异性（阴性符合率）、重复性和检测限项目的检验。操作步骤严格按照各企业检测试剂盒说明书的要求进行，最后对实验结果进行判定。

1.2.3 统计学分析

分别统计样本Ct值的平均值、标准差和变异系数（coefficient of variation，CV）。采用Ct值的CV用于考察试剂盒的精密度。

2 结果

2.1 以企业注册标准/产品技术要求检验

9批次EGFR基因突变检测剂盒准确性、特异性和检测限分别符合各企业注册标准/产品技术要求，重复性检测中，1批次由于抽样量不足，未进行检测，其他8批次均符合规定。

本次监督抽验对同一生产厂家，分别从不同抽样环节、不同适用机型以及不同样本类型进行检测，对比分析不同条件下试剂盒的准确性、特异性、检测限以及精密度。根据表1结果表明不同抽样环节的试剂盒以及不同适用机型条件下的检测结果均符合该生产厂家的注册标准。根据图1中病理组织样本和外周血样本检测扩增曲线和熔解曲线结果可知，病理组织样本在10 ng/μL野生型基因组DNA背景下，对突变DNA含量为5%的检测限参考品能够准确检出；外周血样本在突变DNA含量为10%背景下，对DNA浓度为1 ng/μL的检测限参考品能够准确检出。在针对组织样本和外周血浆样本的检测中，试剂盒均符合该生产厂家的注册标准。

2.2 探索性研究

在本次抽验的探索性研究中，参照产品行业标准《人类EGFR基因突变检测试剂盒》报批稿的要求，同时进行准确性（阳性符合率）、特异性（阴性符合率）、重复性和检测限项目的检验。对5个EGFR检测试剂盒进行检测，结果表明准确性和检测限均有1批次的1个突变位点未检出（表2）。

表1 不同抽样环节获取同一试剂以及不同适用机型同一试剂检测结果比对Table 1 Comparison of the results obtained by different reagents in different sampling procedures and detected from various applicable instruments

在特异性指标中，有5家产品仅对不同浓度的野生型DNA样本进行了规定，要求不得检出，而对于EGFR基因不同序列之间以及HER家族之间是否存在交叉反应并未进行要求，其企业参考品也没有做相应的设置，无法充分检测试剂盒的交叉反应。在探索性研究中，我们对试剂盒检测范围外的人类EGFR不同突变类型参考品进行了检测，包括21个突变位点，要求结果应为突变阴性。检测结果显示5批试剂盒均符合要求，未发现交叉现象。

对于精密度指标，抽检的有部分产品仅要求结果均为阳性，并未对Ct值的变异系数做出要求。仅有2家产品在验证精密度时包括弱阳性、中或强阳性参考品和阴性参考品。其他6家均只对中/强阳性精密度参考品进行检测，且以常见突变类型为主，并未包括理论上较难测得的突变序列。在探索性研究中，我们分别对弱阳性、中或强阳性参考品和阴性参考品进行检测，并选取了较为常见的19-del缺失突变以及较为少见的S768I突变位点。检测结果显示，抽检的5批试剂盒中4个PCR方法的试剂其变异系数均小于5%，另外1个流式荧光杂交法试剂也能结果一致均为阳性，符合规定。

3 讨论

在中国，EGFR基因突变检测试剂盒属于三类体外诊断试剂，须由国家食品药品监督管理总局审查批准后才能颁发医疗器械注册证。因此，在临床应用中，试剂盒的准确性、特异性、检测限、重复性都是质量控制的关键指标，能够反映试剂的基本特性。因此，本研究选取这几项指标来进行试剂盒性能评价。对于无行业标准和国家参考品的产品，企业进行产品注册检验时通常会采用企业标准和参考品进行检验；对于有行业标准和国家参考品的情况下，检验机构会采用行业标准和国家参考品来进行注册检验［13］。然而，针对EGFR基因突变检测的相关行业标准迟于大部分企业标准。因此，企业在研制过程主要依靠企业的产品标准/技术要求进行。

图1 G719A基因检测限结果Figure 1 Detection limit results of G719A gene

表2 EGFR基因突变检测试剂盒结果统计Table 2 Statistics of the detection results of EGFR mutation detection kits

本文采用企业参考品对各自抽检试剂盒（分型或不分型）所能覆盖的所有突变位点进行检测，相应基因型别均能检测出。各企业生产的EGFR基因突变检测试剂盒也都能符合企业产品标准/技术要求。但是企业参考品均来源于质粒构建，并未采用临床样本提取的DNA储备液或细胞系作为原料，所以不能很好的模拟样本真实情况。因此企业参考品无法正确评估检测试剂盒的临床使用情况。鉴于此，本文采用前期制备的临床样本来源人类EGFR基因突变检测统一参考品分别验证抽样试剂盒的准确性、特异性、检测限和重复性。

EGFR是表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor HER）家族成员之一。该家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4 4个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的调节作用。研究表明，EGFR突变主要发生在外显子18～21号外显子上。其中外显子19的缺失突变delE746-A750等约占EGFR突变的45%，外显子21上的L858R替代突变约占EGFR突变的40%～45%［14］。另外10%的EGFR突变发生在外显子18（G719A、G719C和G719S）和外显子20上［14-15］。其中外显子20上的S768I突变约占非小细胞肺癌患者EGFR突变的1.5%～3%左右［16］。本次抽验的EGFR试剂盒所检测的突变位点和数量存在一定的差异，有的仅仅检测2个基因型的10个突变位点，有的基本覆盖常见的30多种突变位点。在探索性研究中，我们采用的统一参考品以临床样本作为原料，覆盖18～21号外显子共4个基因型别的突变类型，可以满足不同试剂盒质控检测的需要。

在探索性研究中，抽检的5批试剂盒在准确性项目中有1个厂家的试剂盒1个位点未检出。准确性检测不符合规定则说明产品出现漏检及假阴性的现象。分析主要原因可能是产品设定的阈值较高，将弱阳性样本检测为阴性。通常在检测限设置时，应分别对扩增反应终体系中的突变序列百分率和反应体系中总核酸浓度2个因素做出规定，在本次抽验的EGFR试剂盒产品中企业注册标准/产品注册要求仅对突变比率进行了要求。另外，检测限的检测应覆盖所有突变位点，而有的EGFR试剂盒产品仅对部分突变位点的检测限进行了检测。在探索性研究中，我们要求试剂盒在10 ng基因组背景下能够检出突变比例（拷贝数）不高于5.0%的混合样本且型别准确。在统一参考品的检出下，有1个产品检测限不符合要求。检测限不符合规定则说明产品的灵敏度不够，对于突变频率较低的样本无法检出。由此可见，企业提供的参考品和统一参考品对试剂盒的测试存在差异。注册检验时采用企业参考品不能完全满足临床对诊断试剂盒的质量要求。因此，针对EGFR基因突变检测试剂盒的国家参考品以及相应行业标准对于产品质量把控具有十分重要的作用。

临床常用的检测样本类型有肿瘤组织基因组DNA和外周血中的游离DNA。其中，组织样本是基因突变检测的“金标准”［17］。血液样本可作为组织样本不易获取时的补充样本［18］。本文抽验的试剂盒中，有部分厂家产品说明书的预期用途中表明该产品用于体外定性检测肠癌、肺癌患者石蜡包埋病理标本和外周血分离的血浆样本的DNA中人类EGFR基因突变。由于EGFR病理组织学样本和外周血样本检测中存在较大差异性，在参考品及质控品设置、分析性能评估、临床评价要求、产品技术要求、产品说明书等多个方面均存在不同要求。本文对同一厂家试剂盒分别采用病理组织样本和外周血样本检测，检测结果符合该生产厂家的注册标准。

总之，各企业产品技术要求存在差异，企业参考品及产品技术要求并不能完全反应试剂盒的质量，结果与即将正式实施的行业标准有一定差距。张欣涛等［19］在2013-2016年的监督抽验中均发现存在企业产品技术要求低于国家行业标准的情况。因此，针对我国人EGFR基因突变检测试剂盒的发展现状，建议企业及时根据行业标准更新企业技术要求，并统一使用国家参考品进行检测。