小麦α-醇溶蛋白体外克隆表达及脱酰胺改性对面条机械特性的影响

廖 兰，张风丽，李章发，陈林萍，林维杰，杨彦红，文晓艳，倪 莉

小麦是我国三大粮食来源之一[1]。小麦蛋白是小麦的副产物，主要由麦谷蛋白和麦醇溶蛋白组成，被当作食品添加剂广泛应用于食品领域[2-4]。麦醇溶蛋白对面团的延展性有重要影响，可分为4 种类型，即α-、β-、γ-和ω-醇溶蛋白[5-8]，其中α-醇溶蛋白毒性最大，是引起乳糜泻的主要蛋白质[9-12]。由于小麦醇溶蛋白不同亚基类型和麦谷蛋白具有较高的分子同源性，因此用传统分离纯化方法分离出α-醇溶蛋白难度较大[13]。目前，利用大肠杆菌表达、提取蛋白，测定揉混实验参数已经成为研究α-醇溶蛋白功能的重要方法。李敏[14]利用Escherichia coli体外表达表达得到α-醇溶蛋白，将其添加到基础面粉中，利用粉质仪研究其对面团流变学特性影响，发现α-醇溶蛋白会使面团带宽和机械耐力系数有所增加，而缩短面团的稳定时间和形成时间。刘国娟[15]发现α-醇溶蛋白可以缩短揉面时间并增加面团耐揉性。小麦面筋蛋白含有大量的疏水性氨基酸谷氨酰胺和天冬酰胺，导致其难溶于水，限制了其在食品行业上的应用[16]。脱酰胺改性可以将酰胺基转化为羧基从而提高其溶解性[17]。Shih[18]、Liao Lan[19]和Wang Yongquan[20]等的研究发现酸可以更加有效地将酰胺基团转变为羧基，从而改善小麦面筋蛋白的功能性质。Berti等[21]发现醋酸可以降低小麦蛋白的致敏性。本研究通过体外克隆表达的方法得到α-醇溶蛋白，利用柠檬酸对α-醇溶蛋白进行脱酰胺改性，并将其添加到面粉中，研究脱酰胺改性α-醇溶蛋白的结构变化对面条质地的影响，为进一步研究柠檬酸改性对α-醇溶蛋白致敏性的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

pUC57-α-gliadin由实验室保存；克隆和表达试剂、DNA凝胶回收纯化试剂盒 大连宝生物工程有限公司；周麦28面粉 河南周园种业有限公司；其他所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

VeritiTM96-well聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）梯度扩增仪 Applied Biosystems（中国）科技有限公司；JS-680B全自动凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司；8210E傅里叶变换红外光谱仪 美国尼高力仪器公司；FluoroMax-4荧光分光光度计 法国Horiba Jobin Yvon公司；SH-4000扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 韩国HIROX公司。

1.3 方法

1.3.1 pUC57-α-gliadin转化感受态细胞及序列分析

根据GenBank公布的α-醇溶蛋白基因编码区两端保守区设计1 对引物，引物序列为P1：5’-ATGAAGACCTTTCTCATCCTT-3’、P2：5’-GTTAGTACCGAAGATGCCAAATG-3’，将pUC57-α-gliadin转化至DH5α，蓝白斑筛选阳性菌。以阳性菌为模板进行PCR鉴定，以不含目的基因的DH5α为对照组，PCR产物用质量分数1%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）检测鉴定后送测序公司进行DNA测序，采用NCBI在线BLAST进行序列同源性比对，用DNAMAN软件翻译DNA序列。

1.3.2 表达载体的构建和鉴定

根据目的序列完整编码区，利用Primer Premier 5.0软件设计1 对表达引物P3：5’-CGCCATATGGTTAGAGTT CCAGTGCCA-3’、P4：5’-CCGCTCGAGGTTAGTACCG AAGATGCCAAATG-3’，在上游引物P3、下游引物P4的5’端分别引入酶切位点Nde I和Xho I，以阳性质粒为模板扩增并回收目的基因。PCR产物于1% SDS-PAGE检测后回收，回收的PCR产物及pET-22b（+）质粒分别用Nde I和Xho I进行双酶切，酶切片段经纯化回收，用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜，连接产物转化至DH5α，双酶切鉴定阳性克隆后进行测序。

1.3.3 融合蛋白的表达和纯化

阳性重组质粒pET-22b-α-gliadin转入宿主细菌E. coli BL21（DE3）中，挑取单菌落接种在5 mL LB培养液中（含100 μg/mL氨苄青霉素），在37 ℃下振荡培养过夜。按照1∶100的比例接种于新鲜液体LB培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素）上，37 ℃振荡培养至OD600nm值为0.6～0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）至终浓度为1 mmol/L，37 ℃下培养18 h，20 ℃、10 000 r/min离心5 min，收集菌体，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗两次。取部分菌体超声破碎处理后进行SDS-PAGE分析。根据Arentz-Hansen等[22]的方法，用预热至60 ℃的体积分数70%乙醇溶液重悬菌体，60 ℃下水浴2 h，菌悬液在20 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液，进行SDS-PAGE分析。加入上清液2 倍体积的1.5 mol/L氯化钠溶液，4 ℃下过夜沉降α-醇溶蛋白，离心收集沉淀，透析后冷冻干燥。

1.3.4 α-醇溶蛋白脱酰胺改性

根据Liao Lan等[19]的方法，配制含0.04 mol/L柠檬酸的α-醇溶蛋白悬浮液（质量分数1%），在水浴锅中常温水化8 h后放入灭菌锅中121 ℃湿热脱酰胺10 min，于4 ℃、9 500 r/min离心10 min后得到上清液，在4 ℃透析24 h除去盐离子，冻干，得到脱酰胺改性的α-醇溶蛋白。

1.3.5 傅里叶变换红外光谱测定

根据Liao Lan等[23]的方法。称取2 mg样品及200 mg KBr，在干燥条件下研磨至均匀，压片，全波段扫描（4 000～400 cm－1），用PeakFit v4.12软件去卷积和二阶求导，分析酰胺I带区域（1 700～1 600 cm－1）图谱二级结构含量。

1.3.6 内源性荧光扫描

根据Wu Haohao等[24]的方法，待测样品溶于体积分数70%乙醇溶液中（1.0 mg/mL）。荧光分光光度计的测定条件为：激发波长295 nm，记录300～400 nm波长范围的发射光谱。

1.3.7 SEM观察

SEM观察根据李剑平[25]的方法。取干净样品台，均匀贴上长度为3～4 mm的导电胶，粘取少量固体粉末涂抹在导电胶上。将样品台放入喷金仪器的真空室，开启真空泵抽真空。待压力达到2～4 Pa时开始喷金。电流为20 mA，时间为40 s。将样品台放入仪器真空室抽真空，待压力适宜后打开钨灯丝电源，开始观察。

1.3.8 脱酰胺改性α-醇溶蛋白对面条质地影响的测定

根据刘国娟[15]和王灵昭[26]等的方法并作适当调整，分别在10 g面粉中添加20 mg脱酰胺改性和未改性α-醇溶蛋白，搅拌均匀后加入5.0 mL蒸馏水揉成面团，再制成面条，以未加入α-醇溶蛋白的面条作为对照，测定质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）指标。每次将3 根面条水平放置在载物台上，每个样品做6 组平行实验。质构仪设定参数为：轻型刀片探头；Compress模式；测试前速率0.8 mm/s，测试速率0.8 mm/s，测试后速率1 mm/s；测试距离为样品75%厚度；感应力为Auto-5 g。

1.4 数据统计与分析

所有实验均进行平行实验，而且重复2～3 次；样品的测定均重复3～5 次，结果应用SPSS 13.0软件中LSD多维分析法进行方差和显著性分析，以P＜0.05表示差异显著。采用Origin 9.0软件作图。PCR结果用Image lab软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 pUC57-α-gliadin转化及同源性分析结果

图1 pUC57-α-gliadin转化的平板蓝白斑Fig. 1 Clones shown as blue or white plaques on a plate

由图1可以看出，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖苷、IPTG和含氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上有明显的蓝白斑单菌落，可以初步判断pUC57-α-gliadin成功转化到了DH5α感受态细胞中。挑选单菌落进行PCR鉴定，经1.0% SDS-PAGE检测，由图2可以看出，泳道4、8、9在860 bp处出现了PCR产物，证明其为阳性克隆子。测序结果采用NCBI在线BLAST进行同源性分析，结果如表1所示，实验所用α-gliadin序列广泛存在于小麦基因组中，其最高同源性最高达到100%。

图2 pUC57-α-gliadin PCR鉴定结果Fig. 2 Agarose electrophoresis pattern of PCR amplification products of pUC57-α-gliadin

表1 α-gliadin基因序列同源性分析Table 1 Homology analysis of α-gliadin nucleotide sequences

2.2 表达载体pET-22b-α-gliadin构建结果

连接产物转化感受态细胞后，如图3所示，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上可以长出白色单菌落，说明pET-22b-α-gliadin成功进入DH5α感受态细胞并使其产生氨苄抗性。挑选4 个单菌落进行PCR鉴定，经1.0% SDS-PAGE检测，由图4可以看出，泳道1～4在800 bp处出现目的片段。双酶切结果（图5）和测序结果证明其为阳性克隆子。

图3 pET-22b-α-gliadin的转化结果Fig. 3 Transformation of plasmid pET-22b-α-gliadin

图4 pET-22b-α-gliadin阳性克隆子PCR鉴定Fig. 4 Agarose electrophoresis pattern of PCR amplification products of pET-22b-α-gliadin

图5 阳性克隆子双酶切鉴定Fig. 5 Agarose electrophoresis pattern of the double digested plasmid DNA

2.3 诱导表达产物SDS-PAGE分析结果

用DNAMAN软件对表达蛋白氨基酸序列进行推导，氨基酸序列如下：MVRVPVPQLQPQNPSQQQPQEQVP LVQQQQFLGQQQPFPPQQPYPQPQPFPSQQPYLQLLPF LQPQLPYSQPQPFRPQQPYPQPQPQYSQPQQPISQQQQ QQQQQQQQQQQQQQQIIQQILQQQLIPCMDVVLQQH NIVHGKSQVLQQSTYQLLQELCCQHLWQIPEQSQCQA IHNVVHAIILHQQQKQQQQPSSQVSFQQPLQQYPLGQ GSFRPSQQNPQAQGSVQPQQLPQFEEIRNLALQTLPA MCNVYIPPYCTIAPFGIFGTNLEHHHHHH，预测的蛋白质分子质量为32.2 kDa。从图6中可以看出，经过体积分数70%乙醇溶液提取后，在约32.0 kDa处出现一条明显的条带，这与Arentz-Hansen等[22]的结果相似，证明经过诱导后DE3表达出目的α-醇溶蛋白，且用体积分数70%乙醇溶液可以提纯得到目的蛋白，为下一步的实验提供了依据。

图6 α-醇溶蛋白诱导表达产物的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of expressed and purified α-gliadin

2.4 α-醇溶蛋白及其改性后二级结构变化

图7 脱酰胺改性α-醇溶蛋白傅里叶变换红外光谱图Fig. 7 Fourier transform infrared spectrum of deamidated α-gliadin

图7 为α-醇溶蛋白经过柠檬酸脱酰胺改性前后的傅里叶变换红外光谱图。对α-醇溶蛋白的酰胺I带（1 700～1 600 cm－1）带进行分峰处理，能够得到5 种蛋白二级结构特征峰（1 604、1 635、1 652、1 679、1 693 cm－1）。

从表2可知，经过柠檬酸脱酰胺改性后α-醇溶蛋白的α-螺旋含量由39.80%下降至33.50%，同时β-折叠结构含量由39.50%上升为52.30%，增加显著，而β-转角含量则从20.70%下降为15.40%。龙伟等[27]指出：蛋白质α-螺旋和β-折叠是存在于蛋白质内部的稳定规则结构，β-转角较多地暴露在蛋白质表面，这使得抗体比较易于和β-转角嵌合，其成为抗原表位的可能性也随之提高；脱酰胺改性后α-醇溶蛋白的β-转角含量下降，说明其成为抗原表位的可能性降低，因此降低α-醇溶蛋白的致敏性。α-螺旋的结构比较紧密且稳定，这不利于蛋白展现良好的功能特性所需要的构象变化[28]。β-折叠和β-转角结构的紧密程度较差且构象稳定性也比α-螺旋结构差，但是它可以改善蛋白质的柔韧性，有利于蛋白质一些功能特性的发挥。α-螺旋/β-折叠的值反映了蛋白质分子柔韧性，比值小则蛋白质柔韧性高[29]。表2显示α-醇溶蛋白经过柠檬酸脱酰胺改性后，α-螺旋/β-折叠由1.00降为0.64，说明柠檬酸脱酰胺改性提高了α-醇溶蛋白分子柔性。

表2 脱酰胺改性α-醇溶蛋白的二级结构含量变化Table 2 Secondary structure composition of deamidated α-gliadin

2.5 α-醇溶蛋白及其改性后内源性荧光变化

图8 脱酰胺改性α-醇溶蛋白内源性荧光扫描图Fig. 8 Endogenous fluorescence spectrum of deamidated α-gliadin

内源性荧光光谱主要由色氨酸残基环境极性的变化确定，是监测溶液中蛋白质含量和蛋白质在界面处构象变化的灵敏方法[29]。如图8所示，经过柠檬酸脱酰胺改性后，改性α-醇溶蛋的λmax从351.5 nm移动到355.3 nm，λmax向长波长方向移动，这是由于经脱酰胺处理后的蛋白结构部分展开，使内源色氨酸基团暴露在溶剂中，色氨酸残基周围的微环境极性增强。说明脱酰胺处理有利于α-醇溶蛋白构象的展开。

2.6 SEM观察结果

醇溶蛋白是只含有分子内二硫键的单体蛋白质，由于没有亚基结构和分子间二硫键，醇溶蛋白肽链之间通过氢键、疏水键和分子内二硫键连结，形成紧密的三维结构而呈球形[30]。图9a中α-醇溶蛋白呈颗粒状或球形，表面粗糙重叠在一起。图9b中可以看出α-醇溶蛋白经过柠檬酸湿热脱酰胺改性后，形成表面光滑均匀的块状。说明脱酰胺改性对α-醇溶蛋白作用效果非常明显，使其结构发生了剧烈的变化。

图9 脱酰胺改性α-醇溶蛋白SEM扫描图Fig. 9 SEM photomicrographs of deamidated α-gliadin

2.7 α-醇溶蛋白及其脱酰胺改性后对面团质地的影响

为进一步探究柠檬酸脱酰胺改性α-醇溶蛋白对面条质地的影响，利用质构仪测定了添加α-醇溶蛋白和柠檬酸脱酰胺改性的α-醇溶蛋白的面团制成面条的TPA指标，以期对脱酰胺改性α-醇溶蛋白的应用提供参考。

表3 脱酰胺改性α-醇溶蛋白对面条质地的影响Table 3 Effect of deamidated α-gliadin on textural properties of noodles

如表3所示，总体而言，添加了α-醇溶蛋白的面条除了黏着性由（396.34±3.57）g·s降为（264.30±7.95）g·s外，对于其他参数，α-醇溶蛋白的添加影响有限。而对于添加了柠檬酸脱酰胺改性α-醇溶蛋白的面条，其硬度由（6 941.31±3.76）g下降为（6 063.64±4.88）g，黏着性提高至（486.71±6.59）g·s，同时，面条的胶着性下降了534.39 g，咀嚼性下降了637.16 g，降幅明显；而面条的弹性、黏聚性以及回复性则没有发生太大变化。这说明经过柠檬酸脱酰胺改性后，α-醇溶蛋白会提高面条的黏性而降低面条硬度，对于弹性的影响较小。

3 结 论

本实验通过体外表达、分离纯化得到小麦α-醇溶蛋白，研究了在柠檬酸湿热脱酰胺处理10 min后小麦α-醇溶蛋白的分子结构的变化，以及改性后对面条质地的影响，主要得出以下结论：1）经过柠檬酸脱酰胺改性后，α-醇溶蛋白的α-螺旋和β-转角结构含量降低，β-折叠结构的含量增加，α-螺旋/β-折叠下降，说明α-醇溶蛋白的分子柔性得到提高，有利于α-醇溶蛋白相关功能特性的发挥。2）脱酰胺改性后α-醇溶蛋白内源色氨酸暴露，蛋白结构展开，SEM观察结果进一步说明脱酰胺改性使α-醇溶蛋白结构发生剧烈变化。3）TPA实验结果表明，脱酰胺改性α-醇溶蛋白可以显著提高面条的黏性而降低面条硬度，为α-醇溶蛋白的应用提供理论依据。以上结果表明，利用柠檬酸对α-醇溶蛋白进行脱酰胺改性改善了α-醇溶蛋白的功能性质，具有一定的理论价值和实际意义，可为开展α-醇溶蛋白致敏性研究提供参考。