成纤维细胞在皮肤损伤修复中的研究

曲广男，冯颖，姜爽，孙悦

摘要：目的：研究成纤维细胞在皮肤损伤修复中的作用。方法： 建立大鼠背部皮肤损伤的动物模型，将新生乳鼠的成纤维细胞悬液注射入受损部位，分别于伤后不同时间观察大鼠背部创面的外观变化及其愈合情况，用创面肉芽组织制作冰冻切片，以损伤皮肤的恢复情况来评价修复效果。结果：注射了成纤维细胞的大鼠，与未注射成纤维细胞的大鼠相比损伤修复的速度明显变快，愈合指数较高。结论：成纤维细胞对组织缺损的修复有促进作用。

关键词：成纤维细胞；细胞培养；皮肤损伤；创面愈合

项目基金：通化师范学院大学生创新创业训练计划项目（201710202033）；通化师范学院实验室开放基金

中图分类号：L929 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.18.022

成纤维细胞具有分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活、增殖较快等优点，可进行一般创伤修复和骨创伤修复。皮肤创伤会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增殖和细胞间质的形成来进行组织修复。本实验采用细胞疗法将新生乳鼠的成纤维细胞注入皮肤损伤的动物模型中，研究成纤维细胞在创面修复中的作用[1-2]。

1材料与方法

1.1 材料、药品与仪器

1.1.1 材料 新生大乳鼠、成年大鼠购于吉林大学医学部动物中心。

1.1.2 藥品 PBS缓冲液、40g/L中性蛋白酶、2.5g/lΙ型胶原酶、低糖DMEM、脱毛剂、咪达唑仑麻醉剂、台盼蓝染液、苏木精染液、伊红染液、二甲苯、10%中性甲醛、包埋剂、中性树胶等。

1.1.3 仪器 低速离心机、恒温摇床、冷冻切片机，超净工作台等。

1.2 成纤维细胞体外的分离培养

1.2.1 分离表皮和真皮 新生大乳鼠处死后在75%酒精中浸泡3min，取背部皮肤，用PBS缓冲液洗涤3次，皮肤剪成5mm×5mm的小块，置入40g/L中性蛋白酶溶液中消化3～4h。取出后PBS缓冲液洗涤，分离表皮层与真皮层，真皮备用。

1.2.2 制备细胞悬液 真皮剪碎后加入0.25%Ⅰ型胶原酶溶液，37℃恒温摇床振荡4h，PBS稀释终止消化，200目尼龙纱网过滤，收集滤液。1200r/min离心5min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM培养液，反复吹打制成细胞悬液。台盼蓝染色，细胞计数[5]，调整细胞悬液的浓度1.0×107个/ml。

1.3 大鼠皮肤损伤模型的建立及分组

对24只体重75g的大鼠进行乙醚气体吸入麻醉，腹腔注射1.4ml麻醉药咪达唑仑稀释液麻醉，背部用脱毛剂脱毛，常规消毒背部皮肤，前后各做一皮肤损伤创伤，创伤伤口的直径约1.5cm，深达皮下，损伤不伤及肌肉，压迫止血[6]。然后将大鼠随机分成A、B两组，A组12只，作为处理组，向创面皮肤真皮内注射0.3ml的原液；B组12只，作为对照组，注射等体积的生理盐水（0.9%的氯化钠水溶液），为避免肿胀，多选几个位置进行注射。注射时为皮下注射给药，分别将成纤维细胞和生理盐水推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环。每只小鼠给予清洁饲料及自来水，分笼饲养，并保持创口干燥，用碘伏擦拭于创口处，间隔一天擦拭一次，直到伤后第12d，以防止创口感染。

1.4 观察指标

1.4.1 创面面积测定 伤后分别于第3d、6d、9d、12d用透明薄膜覆盖创面并沿创缘划线。动物致伤后立即测的面积为伤口原始面积。愈合指数=（1-现切口面积/原切口面积）×100%[2]。

1.4.2 组织学检查 伤后第12d颈椎脱臼法处死大鼠，画出创面大小，然后剪下创面内肉芽组织，放于10%中性甲醛（福尔马林）中固定1小时，生理盐水洗涤，滤纸吸干其上的水后用包埋剂包埋于组织支撑器上，快速放于冷冻台上冷冻，制作冰冻切片，在光学显微镜下观察，凡可观察到真皮、表皮层的可进行HE染色，在材料周围滴加中性树胶，盖上盖玻片，显微镜下观察结果。

1.4.3 统计学处理 所有数据均以“均数±标准差（x±s）”表示，使用Excel统计软件处理，采用方差分析，两两比较，使用组间配对t检验，P<0.05为有显著性差异意义[7]。

2 结果与分析

2.1 给药后创面外观的变化

处理后的创面面积随伤后时间延长而不断缩小[8]，注射了成纤维细胞的创面面积缩小最明显，愈合程度大，并于伤后第12d创面长出一层较密的毛，而对照组只长有少量的毛。

2.2 创面愈合程度

（t检验：平均值的成对二样本分析，得出P<0.05，与对照组比较。）

造模后，随时间的延长创面面积逐渐缩小。伤后第3d，两组大鼠的创面开始逐渐缩小。伤后第12d大部分创面已经愈合，A组的愈合程度强于B组，且愈合速度较快。经t检验，从伤后第9d开始，实验组细胞层数较多，分层明显，创面愈合程度大，显著高于对照组，有明显的加速创面面积缩小的作用（P<0.05），差异显著。

2.3 组织学检查

在显微镜下，可以清晰地观察到表皮层与真皮层，对比发现，FB组细胞分层较为明显，表皮层明显增厚，真皮层中成纤维细胞大量增殖，而对照组的表皮层略微增厚（见图1、图2、图3、图4）。

3 讨论

皮肤受损，成纤维细胞是最主要的修复细胞，是构成肉芽组织的主要成分之一。损伤刺激后，成纤维细胞在趋化因子的作用下进入创口并分裂增殖，与毛细血管及渗出的炎细胞构成肉芽组织。在伤后5～7d肉芽组织达到高峰，成纤维细胞数量剧增，功能活跃[9]。

创面修复是一个复杂的生物学过程，涉及创面炎性翻译、肉芽组织增生以及再上皮化等主要过程。成纤维细胞应用于创面总的效应是促进创面修复，主要表现在促进新生肉芽组织生长，深入比较处理组与对照组的促修复效果，发现处理组的效果较明显，创面愈合程度明显高于对照组，其愈合作用更强[8]。该细胞疗法使细胞再生，从而使大鼠背部皮肤的成纤维细胞增多，并激活大鼠的受损细胞，最终创面愈合。

现已有专家学者提出成纤维细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）可增强成纤维细胞的活性[10]。他们认为有针对性地应用生长因子，治疗既可最大限度发挥生长因子本身的生物学作用，同时也会避免或预防许多可能的不良反应，以达到经济与最佳的促修复效果。因此，在临床应用中成纤维细胞可广泛应用于体表创面修复的研究及医疗的其他领域[8]。

参考文献

[1]程飚，付小兵，盛志勇，等.成纤维细胞生长因子对烫伤大鼠原癌基因和抑癌基因蛋白的影响[J].中国危重病急救医学，2002，14（07）：397-399.

[2]董亚琳，贺浪冲，陈方.塔斯品碱对大鼠皮肤创伤和对成纤维细胞增殖及分泌的影响[J].中药材，2005，28（07）：579-581.

[3]赵雷，陈昕，周余来.EGF对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响[J].吉林医学，2004，25（06）：23-24.

[4]盛利琴，叶荣，韩甫.昆明小鼠胚胎成纤维细胞的分离与体外培养[J].苏州大学学报（自然科学版），2007，23（01）：83-86.

[5]李惠斌，蔡景龙，潘博，等.成纤维细胞体外培养、冻存及复苏的实验研究[J].中国美容医学，2005，14（04）：394-396.

[6]林子清，董玉贞，张晓东，等.小鼠皮肤损伤修复过程中白细胞介素-6对某些炎症因子基因表达的影响[J].遗传学报，

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[7]李德全，黄晓元，杨兴华.离体人皮肤成纤维细胞热损失后转归的形态学观察[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，

12（11）：2056-2060.

[8]傅小兵，孙同柱，王亚平，等.表皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子促进创面修复效应的比较性研究[J].中国修复重建外科杂志，1993，13（05）：278-282.

[9]谭震，宫苹，赵青，等.碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞和牙周膜成纤维细胞迁移、增殖的影响[J].华西口腔医学杂志，2005，23（03）：201-203.

[10]刘，沈海琦.堿性成纤维细胞生长因子与骨折后的组织修复重建[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（33）：6522-6525.

作者简介：曲广男，在读本科生，研究方向：生物技术。

通讯作者：冯颖，硕士，讲师，研究方向：干细胞细胞生物学。