CD47在乳腺癌及癌旁组织中的表达及其意义

陈 涛，王 璇，程 凯，马恒辉，王婧洁，李汉君，曾慧娟，王璐璐，王少华

0 引 言

乳腺癌已经成为女性发病率最高的肿瘤，且是女性癌症中的头号杀手[1-2]。随着医疗技术不断进步，乳腺癌治疗技术日渐成熟且多样化，目前指南推荐的乳腺癌治疗方法包括局部治疗(手术、放疗)，全身治疗(辅助/新辅助化疗、内分泌治疗及分子靶向治疗)[3]。然而，对于进展期或转移性乳腺癌，仍然缺乏显著有效的治疗手段。近年来免疫治疗作为一种新兴的实体瘤治疗方式渐渐成为研究热点[4]。CD47是一种细胞跨膜蛋白，在人类细胞中广泛表达。CD47通常作为“别吃我”信号为人们所认知，即表达CD47蛋白的细胞可通过激活吞噬细胞表面的SIRPα信号通路来防止被吞噬。乳腺癌细胞同样有可能通过表达CD47来逃避免疫监视。因此，本研究旨在探索CD47在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达情况，分析乳腺癌组织CD47的表达与患者临床特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1数据库数据集收集通过cbioportal网站检索TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中乳腺浸润性导管癌数据集(2012，Nature)[5-6]，并从该网站下载数据集，包括基因数据及相关临床数据, 分析CD47基因突变及表达变异情况，其中基因数据包括4种类型：基因扩增、mRNA上调、mRNA下调、正常拷贝。将基因扩增及mRNA表达上调分为上调组，mRNA下调及正常拷贝者分为正常组，通过Kaplan-Meier分析法分析CD47表达与生存相关性。

1.2病例选取回顾性分析金陵医院病理科2011-2015年的乳腺癌病例资料，随机选取确诊为乳腺浸润性导管癌且术前未接受过治疗的185例患者。这些患者的乳腺癌及癌旁组织均经“中性甲醛固定-石蜡包埋”方式保存。其中Luminal A型35例，Luminal B型68例，表皮生长因子受体-2(CerbB-2)过表达型28例，三阴性 54例。患者均为女性，年龄为25～82岁，中位年龄53岁。对患者采用电话问询方式进行随访，随访至2018年3月。

1.3免疫组化正常前列腺腺上皮细胞组织作为阳性对照，前列腺细胞周围结缔组织为阴性对照。兔抗人单克隆抗体抗CD47购自SIGMA公司(稀释浓度为1∶200)，使用EliVision法进行免疫组化染色。

1.4结果判读染色结果由2位病理科医师采取双盲法各自判读，评估浸润性导管癌细胞及正常乳腺导管腺上皮细胞膜蛋白及细胞质蛋白中CD47的表达情况。判读采用半定量法：按照染色强度及区域划分四个等级，即0～3。细胞无染色为0分，细胞膜弱阳性为1分，超过1/3细胞膜或细胞质染色为2分，细胞膜强阳性染色或超过2/3的细胞膜或细胞质染色为3分[7]。判读过程中仅评定乳腺肿瘤细胞及正常导管腺上皮细胞，而淋巴细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及内皮细胞不计入评定结果。依据乳腺癌细胞CD47表达情况，将患者分为阴性组及阳性组，免疫组化染色结果判定为0分的为阴性组，1～3分的为阳性组。

1.5统计学分析应用SPSS 24.0统计学软件对统计结果进行分析，对评定结果采用二分法进行分组。癌组织及癌旁组织CD47表达结果采用配对χ2检验方法进行统计分析，对癌组织CD47表达情况与病理学指标的相关性采用χ2检验方法，与生存预后的关系则采用Kaplan-Meier分析法分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TCGA分析检索TCGA数据库中乳腺浸润性导管癌共825例样本，其中CD47基因拷贝数发生突变(基因扩增)6例(0.73%)，mRNA表达上调者16例(1.94%)，表达下调者19例(2.30%)，无变异者784例(95.03%)。对这些样本数据进行生存分析，可见上调组中位总生存期为55.6个月，正常组中位总生存期为113.7个月(P=0.0256)。见图1。

图1 TCGA数据库中不同CD47基因突变类型乳腺癌患者的生存分析

2.2CD47在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达形态学特征：镜下可见乳腺浸润性导管癌呈实性巢状或片状分布，向四周浸润性推进；肿瘤周围可见不同程度地分布有淋巴细胞、巨噬细胞等，部分组织可见地图样坏死；癌细胞明显增大呈卵圆形，核质比增加，部分核可见分叶。正常乳腺导管上皮细胞沿乳腺导管内膜规则均匀分布排列，无核增大或分裂现象。CD47在乳腺癌细胞膜表面及细胞质内表达比例高，染色深，正常乳腺导管上皮细胞染色少见。见图2。乳腺癌组织CD47阳性表达率为56.21%(104/185)，癌旁组织中阳性表达率为12.97%(24/185)，乳腺癌组织中癌细胞的CD47表达明显高于正常乳腺上皮细胞(P<0.01)，见表1。

表1乳腺癌组织及癌旁组织CD47表达差异(n=185)

癌旁组织癌组织+-P值+231<0.01-8180

2.3CD47表达与乳腺癌病理学特征相关性185例中，阴性组81例，阳性组104例。通过分析乳腺癌组织中CD47的表达，<45岁乳腺癌患者CD47表达高于年龄≥45岁的乳腺癌患者(68.9%vs52.1%，P<0.05)，提示CD47可能与患者的年龄相关。而CD47在乳腺癌组织中的表达与肿瘤大小、淋巴结转移状态、Ki-67指数、雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)状态、临床分期未见相关。见表2。

2.4生存预后分析185例患者随访时间为13～89个月，中位随访时间59个月，其中14例失访，所有患者3年生存率为92.6%，5年生存率为85.7%。3年无病生存率为86.5%，5年无病生存率为82.4%。Kaplan-Meier分析法分析显示CD47阴性组与阳性组生存未见明显差异(P>0.05),未发现患者乳腺癌组织CD47表达与患者生存预后存在显著相关性。见图3。

表2乳腺癌组织中CD47表达与临床病理学特征相关性(n=185)

项目CD47表达量-+P值年龄(岁)0.049 <451431 ≥456773ER状态0.291 -3942 +4262PR状态0.387 -4855 +3349肿瘤直径(cm)0.111 <22926 ≥25278淋巴结转移0.689 无3947 有4257Ki-67指数∗0.181 <202019 >205179Her2表达0.130 -6269 +1935临床分期0.393 Ⅰ+Ⅱ4868 Ⅲ+Ⅳ3336∗Ki-67指标中,有16例患者未行Ki-67检查

图2 CD47在乳腺癌及癌旁组织的表达

a：总生存曲线；b：无病总生存曲线图3 乳腺浸润性导管癌患者CD47表达与临床预后

3 讨 论

CD47的作用之一是作为树突细胞及巨噬细胞表面的信号调节蛋白(signal regulatory protein-α，SIRPα)的配体[8]，通过与SIRPα结合避免被吞噬细胞吞噬。在细胞表面过表达CD47可能是肿瘤细胞逃避免疫监视的一种生存策略。Kaur等[9]发现一种新型的非SIRPα依赖型的通路，通过这一信号通路，CD47抗体能够抑制肿瘤干细胞的分化，维持肿瘤细胞干性特征。Zhang等[10]研究发现，在离体实验中模拟缺氧环境，肿瘤细胞分泌的缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)能够促进乳腺癌细胞表达CD47，HIFs和CD47相互协同下，能够使肿瘤细胞逃避免疫监视并维持癌细胞干性特征。Baccelli等[11]在检测了Luminal A型乳腺癌的CD47表达后，发现Luminal A型乳腺癌循环肿瘤细胞如果CD47和MET基因同时过表达，则患者更容易发生淋巴结转移，且生存预后更差。Lo等[12]则发现，CD47的表达促进了索拉非尼治疗小鼠体内肝癌时耐药的发生。此外，应用CD47相关抗体治疗肿瘤已经取得了一定疗效，如联合CD47抗体及利妥昔单抗，能够促进吞噬作用并杀灭非霍奇金淋巴细胞[13]。Willingham等[14]发现在CD47相关抗体的干扰下，多种人类肿瘤在NSG小鼠体内的生长均受到抑制。综上，乳腺癌细胞的生长、增殖及转移可能与乳腺癌细胞过表达CD47相关，这提示CD47的过表达与乳腺癌患者预后相关。因此本研究的目的在于研究乳腺癌组织中CD47的表达情况，分析其与乳腺癌患者临床病理特征及预后的相关性。

尽管CD47在人体正常组织中广泛表达，但有前期小样本量研究[15]发现，正常乳腺组织中CD47阳性率低，而在乳腺癌组织表达阳性率高。本研究共入组了185例，结果表明乳腺癌组织CD47阳性率明显高于正常组织，与之前的研究一致。而且在年轻乳腺癌患者中(<45岁)，CD47表达率更高，但年轻乳腺癌患者CD47表达上调的机制还有待进一步研究。

CD47在TCGA数据中的基因检测结果与本研究蛋白水平检测结果存在差异，这提示CD47基因可能在转录和翻译水平上存在调节因素。例如造血干细胞在穿过富含吞噬细胞的骨窦时，会通过表达CD47来避免被吞噬，当其到达合适位置后，将重新下调CD47的表达[16]。肿瘤抑制基因如miR-133a[17]、miR-192[18]和癌基因MYC都能够直接与各种肿瘤的CD47启动子区域相结合进而调控CD47的表达[19]。同时有研究报道，肿瘤细胞中表达的糖调节蛋白78(glucose regulated protein-78，GRP78)能够通过未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)在内质网水平上调CD47的表达[20]。因此还需要进一步探索调节CD47表达的相关机制。

在TCGA数据中，乳腺癌CD47基因扩增或表达上调后对生存的影响有统计学意义，这与部分学者的研究结果一致，提示CD47基因表达变异可以做为乳腺癌患者生存预后分析因素。但本研究中CD47免疫组化检测结果与临床预后的相关性并未达到统计学差异，这可能与CD47基因可能在转录和翻译水平上存在调节因素有关。因此CD47免疫组化结果能否作为乳腺癌患者生存预后的指标仍需要进一步实验验证。

事实上，固有免疫仅仅是肿瘤免疫杀伤的一种方式，适应性免疫同样在肿瘤免疫杀伤中起着重要作用，有研究表明，乳腺癌患者是否出现腋窝淋巴结转移与腋窝淋巴结淋巴细胞构成比相关[21]。在肿瘤细胞表面还表达有一种程序性死亡蛋白配体(programmed cell death 1 ligand，PD-L1)，通过与杀伤性T淋巴细胞表面的程序性死亡蛋白(programmed cell death 1，PD-1)结合从而抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[22]。Casey等[19]研究发现MYC基因能够促进肿瘤细胞表面的PD-L1及CD47表达，进而促进肿瘤的增殖并增强抗肿瘤免疫反应。因此，CD47对于乳腺癌的影响可能不仅仅是单因素的作用，其可能与多种其他免疫因素相互作用，共同调节肿瘤的发生发展。本研究仅检测了乳腺癌组织中CD47的表达，未能得出与病理学指标明显相关的结论，这有可能是因为样本量仍然不足引起，也有可能是存在其他与CD47相互作用的因素从而影响了与病理特征的相关性。此外，本研究仅进行了横断面研究，未能进行纵向对比研究病程进展时CD47的动态变化过程。因此CD47的表达在乳腺癌发生发展中的作用及相关机制还需要进一步的实验来验证。

由于抗CD47抗体在多种肿瘤的体外试验中，尤其是治疗急性粒细胞性白血病中取得了较好的效果[23]，而且除了发生贫血外，并不会对其他正常细胞或组织造成明显影响[14]，目前世界范围内，已经在进行多项关于联合CD47单克隆抗体靶向抗肿瘤的临床试验。本研究通过大样本研究了乳腺癌及癌旁组织中CD47的表达，验证了乳腺癌与癌旁组织中CD47表达存在显著差异，为进一步研究CD47在乳腺癌免疫逃逸及侵袭转移中的作用打下了基础；为研究乳腺癌应用CD47抗体进行靶向治疗提供了依据，也为乳腺癌治疗提供了一种新的策略。